Интегрин напряженности и клеточных силы на субмикронном резолюции с датчиком интегративной напряженности
Summary
Интегрин напряженности играет важную роль в различных функций клеток. С датчиком интегративной напряженности Интегрин напряженности калибруется с чувствительностью picoNewton (pN) и образы на субмикронном резолюции.
Abstract
Молекулярные напряженности, переданные Интегрин лиганд облигаций — основных механических сигнал в Интегрин путь, который играет важную роль во многих функций клеток и поведения. Для калибровки и изображения Интегрин напряженности с высокой силой чувствительность и пространственным разрешением, мы разработали интегративной напряжение датчик (СТС), на основе ДНК флуоресцентные напряженности. ЕЕ активируется для флуоресцировать если поддержания молекулярной напряжение, таким образом преобразование силы в флуоресцентного сигнала на молекулярном уровне. Порог напряжения для ее активации перестраиваемой в диапазоне pN 10-60, который также охватывает весь динамический диапазон Интегрин напряженности в клетках. На подложке, привитый с СТС Интегрин напряженности адэрентных клеток визуализированное флуоресценции и отражаться на субмикронном резолюции. ЕЕ также совместим с структурных изображений клеток в живых клеток и фиксированные клетки. ЕЕ успешно применяется для изучения миграции клеток и тромбоцитов сужением. Этот документ подробно описывает процедуры для синтеза и применения ее в исследовании Интегрин передаются сотовый силы.
Introduction
Клетки полагаются на интегринов присоединиться и оказывают сотовой силы внеклеточного матрикса. При посредничестве Интегрин клеток адгезии и силы передачи имеют решающее значение для ячейки, распространение1,2,3,миграции4и выживания5,6,7. В долгосрочной перспективе Интегрин биомеханических сигнализации также влияет на клетки распространения8,9,10 и дифференциации11,12. Исследователи разработали различные методы для измерения и карта Интегрин передаются сотовый сил в интерфейсе ячейки матрицы. Эти методы основаны на упругие субстрат13, массив micropost14, или атомных сил микроскопии (АСМ)15,16. Эластичные субстрат и micropost методы полагаются на деформации субстратов сообщать клеточного стресса и имеют ограничения с точки зрения пространственного разрешения и заставить чувствительность. AFM имеет чувствительность высокой силы, но он не может обнаружить силы в нескольких местах одновременно, что затрудняет карта сотовой силы передано интегринов.
В последние годы были разработаны несколько методик для изучения клеточных силы на молекулярном уровне. Коллекция молекулярных напряжение датчиков на основе полиэтиленгликоля17,18, паук Шелковый пептид19и ДНК-20,–21,–22,–23 были разработаны для визуализации и мониторинга напряжения, передано низкомолекулярных белков. Среди этих методов ДНК был впервые принят как синтез материала в напряжение датчика троса (TGT), rupturable компоновщик, который модулирует верхний предел Интегрин напряженности в живые клетки22,24. Позже ДНК и флуоресценции техника передачи резонанса были объединены для создания шпильки на основе ДНК флуоресцентные напряжение датчиков сначала Чэня группы23 и Salaita в группы20. Шпилька напряженности на основе ДНК датчик сообщает Интегрин напряженность в режиме реального времени и успешно применяется для изучения ряда клеточных функций21. Потом Ван лаборатории комбинированный TGT с парой Флюорофор утоления доклад Интегрин напряженность. Этот датчик с именем его25,26. Основан на двойной спирали ДНК (dsDNA) и имеет более широкий динамический диапазон (pN 10-60) для калибровки Интегрин напряженности. В отличие от шпильки на основе ДНК датчики ее не сообщают сотовой силы в режиме реального времени, но записывает все события исторического Интегрин как след клеточных сил; Этот процесс накопления сигнала улучшает чувствительность для сотовых силу визуализации, что делает его возможным сотовой силам изображения даже с low-end флуоресцентным микроскопом. Синтез его относительно более удобным, как она создается гибридизировать двух одноцепочечной ДНК (ssDNA).
ЕЕ это 18-base паре dsDNA, конъюгированных с биотин, Флюорофор, утоления (черная дыра утоления 2 [BHQ2])27и циклических Аргинилглициласпарагиновая кислота (РГД) пептида28 как Интегрин пептидных лигандов (рис. 1). Нижняя нить проспряганное с Флюорофор (Cy3 используется в этой рукописи, в то время как другие красители, например Cy5 или Alexa серии, также оказались в нашей лаборатории) и биотин тега, с которым ее это иммобилизованные на подложке биотин авидин Бонд. Верхние пряди проспряганное с пептидной РСЗ и утоления черная дыра, которая утоляет Cy3 с приблизительно 98% тушения эффективности26,27. С протоколом, представленных в настоящем документе плотность покрытия ее на подложке составляет около 1100/мкм2. Это плотность, которую мы ранее калиброванные для 18 bp биотинилированным dsDNA покрытием на подложке neutrAvidin функционализированных следуя то же покрытие протокол29. Когда клетки присоединиться к подложке, с покрытием с ее, Интегрин привязывает ее через РСЗ и передает напряженность для ее. ЕЕ имеет конкретные напряженности терпимости (ТолT), который определяется как порог напряжения, который механически отделяет dsDNA ее в течение 2 s22. ЕГО разрыв Интегрин напряженности приводит к разделение утоления от красителя, который впоследствии испускает флуоресценции. В результате невидимый Интегрин напряжения преобразуется в сигнал флуоресценции и клеточных силы могут быть сопоставлены с флуоресцентным изображений.
Чтобы продемонстрировать применение ее, мы используем рыбы Кератоцит здесь, широко используемых ячеечная модель для клеток миграции исследование30,,3132, Чо-K1 ячеек, часто используемых аэробны клеточной линии и низ 3T3 фибробластов. Также проводится coimaging Интегрин напряженности и клеток структур.
Protocol
Representative Results
Discussion
ЕЕ является весьма доступным, но мощный метод для сотовых силу сопоставление с точки зрения синтез и применение. Со всеми материалами готова ее может быть синтезирован в течение 1 дня. Во время экспериментов необходимы только три шага поверхности покрытия до ячейки покрытия. Недавно мы …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом запуска, Университет штата Айова и от национального института Генеральной медицинских наук (R35GM128747).
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
Referências
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
- Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
- Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
- Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
- Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
- Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
- Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
- Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
- Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
- Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
- Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
- Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).
- Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
- Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
- Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
- Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
- Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
- Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
- Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
- Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
- Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
- Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
- Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
- Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
- Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
- Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
- Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
- Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
- Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
- de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences – Series IV – Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
- Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).
