イメージング インテグリン張力と細胞の力でサブミクロン解像度統合テンション センサーで
Summary
インテグリンの緊張は、様々 な細胞機能に重要な役割を果たしています。統合テンション センサーとインテグリンの緊張はピコニュートン (pN) 感度を校正、サブミクロンの分解能でイメージします。
Abstract
インテグリン ・ リガンド結合によって送信される分子の緊張は、多くの細胞機能や行動に重要な役割を果たしているインテグリン経路で基本的な機械的信号です。調整し、高いフォース感度と空間分解能とインテグリン緊張のイメージに統合張力センサー (ITS)、DNA ベースの蛍光張力センサーを開発しました。ITS はこうして力を分子レベルで蛍光シグナルに変換する蛍光分子の張力を維持する場合にアクティブになります。その活性化のため緊張のしきい値は 10-60 pN も細胞のインテグリン緊張のダイナミック レンジをカバーするの範囲で可変です。ITS をグラフトした基板、付着細胞のインテグリン緊張は蛍光で可視化したし、サブミクロンの分解能で撮像します。ITS は生きているセルの固定セル セル構造のイメージングと互換性も。ITS は、血小板の収縮や細胞遊走の研究に正常に適用されています。本稿は、合成およびインテグリン転送細胞力における ITS のアプリケーションの手順を詳しく説明します。
Introduction
細胞は付着細胞外マトリックスへの細胞力を発揮してインテグリンに依存します。インテグリンを介した細胞接着および力伝達は拡散1,2移行3,4存続5,6,7セルのために重要です。長期、インテグリン生体シグナルも細胞増殖8,9,10と分化11,12を影響します。測定する様々 な方法が開発されて、細胞マトリックス界面強制的にマップ インテグリン送信携帯。これらのメソッドは、弾性下地13に基づいて、配列 micropost14、または原子力の顕微鏡 (AFM)15,16。弾性下地および micropost メソッドは、細胞ストレスを報告し、空間分解能の点で限界がある強制的に感度の基板の変形に依存します。原子間力顕微鏡、高感度化、しかし、それは同時に複数のスポットで力を検出できない、インテグリンによって送信される細胞力をマップし難い。
近年、分子レベルで細胞の力を研究するいくつかの技術を開発しました。ポリエチレング リコール17,18、スパイダー シルク ペプチド19、および DNA20,21,22,23に基づく分子張力センサーのコレクションが開発されました。可視化し、分子蛋白質によって送信される張力を監視します。これらの技術の間で張力で合成素材ゲージ テザー (TGT) 生きているセル22,24のインテグリン緊張の上限値を調節する破裂可能なリンカーとして DNA は初採用。その後、DNA と蛍光共鳴伝送結合されたヘアピン DNA ベースの蛍光張力検出器を作成する最初 chen’s グループ23と Salaita のグループ20。ヘアピン DNA を用いた張力センサー レポートをリアルタイムでインテグリン張力と細胞機能21の一連の研究に正常に適用されています。その後、Wang の実験室はレポート インテグリン緊張する fluorophore クェンチャーのペアと TGT を組み合わせます。このセンサーは、その25,26という名前です。ITS は、二本鎖 DNA (dsDNA) に基づいており、インテグリン張力調整の広いダイナミック レンジ (10-60 pN)。ヘアピン DNA ベースのセンサーと対照をなして ITS リアルタイム細胞力を報告しないが、細胞力のフット プリントとして歴史的なインテグリンのすべてのイベントを記録この信号蓄積プロセスは、イメージング、それに実行可能なイメージの細胞力をローエンドの蛍光顕微鏡とも細胞の力の感度を向上させます。ITS の合成は、2 つの単一座礁させた Dna (ssDNA) を交配させることによって作成されるそれより比較的便利です。
ITS は、インテグリン ペプチド配位子 (図 1) 共役環状 arginylglycylaspartic 酸 (RGD) ペプチド28クェンチャー (ブラック ホール クェンチャー 2 [BHQ2])27日、fluorophore ビオチン 18 ベース ペア dsDNA です。蛍光体と下の鎖を共役 (Cy3 cy5 の組合せまたは Alexa の系列などの他の染料は、ながら、この原稿で使用されて、また私たちの研究室で可能であるが証明されている) と、ITS がビオチン-アビジン結合によって基板に固定化ビオチン タグ。上部のストランドは、RGD ペプチドと約 98% 焼入効率26,と27Cy3 を消光するブラック ホール クェンチャー共役です。本稿で提示されたプロトコル、その基板上のコーティングの密度は 1,100/μ m2の周り。これは、我々 は以前次の同じプロトコル29をコーティングを施した neutrAvidin 修飾基板上 18 bp ビオチン dsDNA のキャリブレーション密度です。セルは、ITS でコーティングされた基板に付着、インテグリンは RGD を ITS をバインドし、ITS に緊張を送信します。ITS は、機械的に 2 s22内 ITS の dsDNA を分ける緊張しきい値として定義されている特定の緊張耐性 (T許容差) を持ちます。インテグリンの緊張によってその破壊はその後蛍光を発する色素から、クェンチャーの分離に します。結果として、目に見えないインテグリン緊張が蛍光信号に変換され、蛍光イメージングによる細胞力をマップできます。
ITS の適用を示すためには、魚ケラトサイトここ、セル移行研究30,31,32の広く使われている細胞モデル、CHO ‐ K1 セル、一般的に使用される非運動性細胞および NIH 3T3 繊維芽細胞を使用します。インテグリンの張力と細胞の構造の coimaging も行われています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ITS は、まだ携帯電話の強力な技術力の合成とアプリケーションの両方の面でマッピングにアクセスが可能です。すべての材料は準備ができて、1 日以内に ITS を合成できます。実験中にセル メッキ前に表面コーティングの 3 つの手順が必要です。最近では、我々 はさらに ITS にウシの血清アルブミンをガラスまたはポリスチレン表面33ITS の直接の物理的な吸着を可能にする?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アイオワ州立大学によって提供されるによって、国立医学研究所の一般的な (R35GM128747) スタートアップ資金によって支えられました。
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
Referências
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
- Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
- Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
- Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
- Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
- Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
- Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
- Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
- Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
- Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
- Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
- Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).
- Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
- Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
- Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
- Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
- Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
- Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
- Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
- Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
- Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
- Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
- Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
- Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
- Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
- Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
- Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
- Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
- Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
- de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences – Series IV – Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
- Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).
