Beredning av nyfödda råtta hjärn vävnad för ultrastrukturella Morphometric analys av synaptic Vesicle distribution på Nervterminaler

Summary

Vi beskriver förfaranden för behandling av nyfödda råtta hjärn vävnad att få högupplösta elektronmikrografer för morfometriska analys av synaptisk vesikler distribution vid nervterminaler. De mikrografer som erhålls med dessa metoder kan också användas för att studera morfologin hos ett antal andra cellulära komponenter och deras dimensionella strukturella relationer.

Abstract

Vårt laboratorium och många andra har utnyttjat den höga upplösnings kraften i transmissionselektronmikroskopi för att studera morfologin och den rumsliga organiseringen av synaptiska vesikler. För att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer som kan ge den grad av morfologisk detalj som krävs för kvantitativ analys av pre-synaptisk vesikeldistribution är optimal preparat preparering kritisk. Kemisk fixering är det första steget i processen för preparat beredning, och av yttersta vikt för att bevara fina ultrastruktur. Vaskulär fixering med en glutaraldehyd-formaldehyd lösning, följt av behandling av vibratome-Snittade prover med osmium tetroxid, stabiliserar det maximala antalet molekyler, särskilt proteiner och lipider, och resulterar i överlägsen bevarande av ultrastruktur. Vävnad bearbetas sedan med counterfärgning, sekventiell uttorkning och harts-inbäddning. En block färgning med uranyl acetat (dvs färgning av vibratome-snittad vävnad innan harts inbäddning) förbättrar endogena kontrasten och stabiliserar cell komponenter mot extraktion under preparat bearbetning. Kontrasten kan ökas ytterligare genom applicering av uranyl acetat som en post-fläck på ultratunna sektioner. Dubbel färgning av ultratunna sektioner med blycitrat efter behandling med uranyl acetat förbättrar också bildens upplösning, genom att intensifiera elektron-opacitet av nukleinsyra-innehållande strukturer genom selektiv bindning av bly till uranyl acetat. Transmission elektronmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för karakterisering av morfologiska Detaljer av synaptiska vesikler och kvantifiering av deras storlek och rumsliga organisation i terminalen Bouton. Men eftersom den använder fast vävnad, transmissionselektronmikroskopi kan bara ge indirekt information om levande eller föränderliga processer. Därför bör andra tekniker övervägas när huvud syftet är att studera dynamiska eller funktionella aspekter av synaptisk vesikel trafficking och exocytos.

Introduction

Vi beskriver metoder för beredning av hjärn vävnad från nyfödda råttor för att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer för djupgående morphometrisk analys av synaptisk vesikelspatial fördelning vid nervterminaler^1,2. De hög kontrast mikrografer som kan erhållas genom bearbetning av prover efter dessa metoder kan också användas för att studera den detaljerade morfologin av ett antal cellulära komponenter och deras dimensionella strukturella relationer^3,4.

Transmission Electron Mikroskop (TEM) är ett kraftfullt verktyg för att studera morfologi av organeller andra cellulära strukturer kvantitativt. Från och med detta årtionde, det finns inga andra metoder för utredning som kan ge samma grad av upplösning av Lipidmembran och organeller utan immuno-taggning, med undantag för kryofixering genom högtrycks frysning. Emellertid, frysa substitutions tekniker används inte i stor utsträckning, och normalt kräver dyr utrustning och långa förberedelse tider.

För att kunna dra nytta av TEM: s höga upplösnings effekt är optimal preparat beredning av största vikt. De viktigaste målen för preparat preparatet är att bevara vävnads strukturen med minimal förändring från den levande tillstånd, förbättra preparat kontrast, och stabilisera vävnaden mot utvinning av cellulära komponenter under bearbetning och exponering för elektronen Beam. Många protokoll för TEM vävnads beredning har införts och fulländat av flera laboratorier under årens lopp. Många av dem har fokuserat på metoder för optimal visualisering av synaptiska vesikler^{5,6,7,8,9,10,11}. Bland ett antal väletablerade, guldmynt standard metoder som för närvarande används, valde vi förfaranden för kemisk fixering, post fixation, en Bloc färgning, sekventiell uttorkning, harts inbäddning och efter färgning som syftar till att bevara optimal vävnads struktur och uppnå utmärkt bild kontrast. Notera, bevarandet av fina ultrastruktur kan vara särskilt utmanande när man arbetar med nyfödda råtta hjärn vävnad. Faktum är att det centrala nerv systemet hos mycket unga djur kännetecknas av en högre vatten halt än den vuxna hjärnan, mer framträdande utvidgning av extracellulära utrymmen, och lösare anslutningar mellan cellerna¹². Detta gör nyfödda råtta hjärn vävnad djupt känslig för förändringar i osmolaritet, och utsökt benägna att artifaktuella krympning och/eller svullnad när bearbetas genom sekventiella lösningar av olika Tonicity¹². Därför använde våra metoder lösningar för preparat bearbetning som är av osmolaritet så nära som möjligt till den hos råtta nyfödda hjärnan. Vårt mål var att få högkvalitativa, högupplösta elektronmikroskopi bilder för kvantitativ bedömning av synaptisk vesikel spatial distribution vid nervterminaler. Specifikt försökte vi mäta antalet vesikler i nerven terminalen, avståndet till synaptiska vesikler från pre-synaptiska plasma membranet, antalet vesikler dockad vid pre-synaptiska membranet, storleken på synaptiska vesikler och Inter-Vesicle avstånd¹.

Tillfredsställande kemisk fixering är en förutsättning för att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer som kan ge den morfologiska detalj som krävs för att studera synaptisk vesikelmorfologi och spatial organisation. Även om flera lägen för fixering finns, fixering av hjärn vävnad genom vaskulär per fusion är avgjort överlägsen andra metoder. Eftersom fixering via vaskulär per fusion börjar omedelbart efter gripandet av systemisk cirkulation, förkortar det intervallet mellan syresättning av hjärn vävnaden och tvär bindning av proteiner med fixativ, vilket resulterar i minimala förändringar i cell Struktur. Dessutom åstadkommer det snabb och enhetlig penetration, på grund av det snabba flödet av fixativ från kärl bädden till extracellulära och cellulära fack^12,13,14. Primär fixering med glutaraldehyd, följt av sekundär fixering (post-fixation) med osmium tetroxid, ger utmärkt bevarande av den fina strukturen^15,16,17. En blandning av glutaraldehyd och paraformaldehyd har den extra fördelen av mer snabb penetration i vävnaden¹².

Eftersom biologiska vävnader inte är tillräckligt stela för att skärs i tunna partier utan stöd av en harts matris, måste de bäddas in i ett medium innan tunn snittning. Vatten-immiscible epoxihartser används ofta som en inbäddning medium i TEM. När denna typ av matris används, måste alla preparat fritt vatten bytas ut mot ett organiskt lösnings medel före harts infiltration. Vatten avlägsnas genom att provet passerar genom en serie lösningar av stigande koncentrationer av etanol och/eller aceton¹². I detta protokoll är proverna först plana inbäddade mellan flexibla aclar ark, sedan inbäddade i en kapsel. resultatet är vävnad som ligger på spetsen av ett cylindriskt harts block, som har den ideala geometri som minst påverkas av vibrationer som uppstår under mikrotomen snittning.

Färgning med tung metaller för att förbättra endogen vävnad kontrast är en annan viktig aspekt av preparatet preparat. Bildens kontrast i TEM beror på elektrons spridning av atomerna i vävnaden. Biologiskt material består dock till stor del av låga Atom vikt molekyler (dvs. kol, väte, syre och kväve). Därför kräver generering av tillräcklig spridning kontrast införlivandet av hög Atom vikt atomer i cellulära komponenter i vävnaden. Detta uppnås genom färgning av preparatet med tung metaller^12,18,19. Osmium tetroxid, uran och bly, som binder starkt till lipider, är de vanligaste tung metaller som används som elektron fläckar.

Osmium (Atom nummer 76) är en av de tätaste metallerna i tillvaron. Det är både en fixativ och en fläck, även om dess primära roll i TEM är som en pålitlig fixativ¹². Bland de olika bindnings protokoll som används är metoden för dubbel fixering med glutaraldehyd som följs av osmium den mest effektiva för att reducera extraktionen av cell bestånds delar under preparat preparatet. Dessa två fixativ används för att stabilisera det maximala antalet olika typer av molekyler, särskilt proteiner och lipider, och resultera i överlägsen bevarande av vävnad ultrastruktur^{12,14,15, 16} för att ^, och ¹⁷.

Uran (Atom nummer 92) är den tyngsta metallen som används som elektron fläck, oftast i form av uranyl acetat. På samma sätt som osmium, fungerar den som en fläck och fixativ, även om dess primära roll i tem är som en fläck^20,21. Nukleinsyra-innehållande och membranös strukturerar är starkt och befläckas prioriterat med uranyl saltar i aldehyde-fixade vävnader^22,23. Behandling av vävnader med uranyl acetat efter osmication och före Dehydrering resulterar i stabilisering av membranös och nukleinsyra-innehållande strukturer, samt förbättrad kontrast, och tillåter identifiering av vissa strukturella detaljer som inte skulle kan lätt upptäckas i prover som har betats med osmium ensamt^12,24,25. Det är tänkt att uranyl acetat kan stabilisera den fina strukturen genom att kombinera med reducerad osmium som har deponerats på Lipidmembran under osmication²⁴. Maximal kontrast uppnås när uranyl acetat appliceras före inbäddning och som en post-fläck i tunna avsnitt¹².

Bly (Atom nummer 82) är den vanligaste fläcken som används för TEM och är främst anställd för efter färgning av tunna sektioner. Blysalter har hög elektron opacitet och visar affinitet för ett brett spektrum av cellulära strukturer, inklusive membran, nukleära och cytoplasmatiska proteiner, nukleinsyror och glykogen^26,27. När dubbel färgning metoden är anställd (dvs, färgning med uranyl acetat följs av behandling med bly), den senare fungerar som en utvecklare av uranyl acetat färgning. Till exempel, bly efter färgning av kromatin fast med glutaraldehyd ökar uranyl acetat upptag med en faktor på tre^{28,29,30,31,32}. Bly ökar också färgning förmedlas av andra metaller som osmium. Det är tänkt att bly salter fläcken membranen av osmium-fasta vävnader genom att fästa till Polar gruppen av fosfatider i närvaro av reducerad osmium³³. En potentiell nackdel med färgning med både uranyl acetat och bly, särskilt för långvarig varaktighet, är att många olika strukturella element är färgade lika och icke-specifikt, och därmed inte kan lätt skiljas från en annan¹² .

Den senaste tidens införande av alternativa ljus källor, såsom i optisk super-upplösning foto-aktiverad lokalisering mikroskopi, har betydligt bättre ljus mikroskopi upplösning³⁴. Men eftersom ljus mikroskopi förlitar sig på histokemiska och immuncytokemiska metoder för att visualisera individuellt märkta proteiner eller enzymer, kraften i TEM för att visa alla strukturella element på en gång är oöverträffad för fördjupad studie av morfologi och dimensions relationer i vävnads strukturer. I synnerhet, ingen annan teknik kan ge den morfologiska detaljer som krävs för att utföra morphometriska analys av synaptisk vesikler distribution vid pre-synaptiska nerv boutons. Det är dock viktigt att notera att elektronmikrografer fångar strukturen i vävnaden efter att organismen dör, och därför kan de inte ge information om dynamiken i pre-synaptisk vesikel trafficking och exocytos. Därför, andra verktyg, såsom FM färg-Live Imaging och patch-Clamp elektrofysiologi, bör övervägas när det huvudsakliga målet är att studera dynamiska och/eller funktionella aspekter av synaptisk vesikel trafficking och exocytos.

Protocol

Alla studier godkändes av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén vid University of Virginia (Charlottesville, VA) och genomfördes i enlighet med de nationella hälso instituten rikt linjer. 1. fixering genom vaskulär perfusion Anmärkning: En allmän beskrivning av metoden för råtta hjärna vaskulär per fusion har redan detaljerade i denna tid skrift13 och ligger utanför tillämpningsområdet för d…

Representative Results

Allmänna kriterier som oftast godtas som indikation på tillfredsställande eller defekt bevarande av preparat för TEM har fastställts. Dessa kriterier exemplifieras i fyra utvalda elektronmikrografer (två exempel på optimala förberedelser, två exempel på defekt preparering) som erhölls genom behandling av unga råtta hjärn vävnad enligt de metoder som beskrivs i detta protokoll. I allmänhet, en god kvalitet elektron mikrograf visas som en ordnad, distinkt och övergripande gråakt…

Discussion

Hantering av vävnads sektioner under preparat preparering för TEM kräver en avsevärd grad av finess, koncentration och tålamod. När du använder en mikropipett för att lägga till och ta bort lösningar, kan proverna sugs in i pipettspetsen med ytspänning, så du bör vara noga med att undvika vävnads skada genom pipetten. Också, vissa steg i dehydratiseringssekvensen kan vara så snabb som 1 min, därav operatören måste arbeta snabbt för att säkerställa att nästa Dehydrering steg startas i tid och prepar…

Materials

4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder