הכנת התינוק היילוד רקמת המוח עבור ניתוח בדיקת מבנית באולטרסאונד של הפצת שלפוחית סינפטית במסופי העצבים
Summary
אנו מתארים הליכים לעיבוד רקמות המוח היילוד הנולד כדי להשיג מיקרוגרפים אלקטרונים ברזולוציה גבוהה עבור ניתוח מורמטרי של הפצת שלפוחית סינפטית במסופי העצבים. המיקרוגרפים שהושגו בשיטות אלה יכולים לשמש גם לחקר המבנה של מספר רכיבים סלולאריים אחרים ולמערכות היחסים המבדיות שלהם.
Abstract
המעבדה שלנו ורבים אחרים ניצלו את העוצמה הגבוהה ביותר של מיקרוסקופ אלקטרוני שידור לחקר המבנה והארגון המרחבי של שלפוחיות סינפטית. כדי להשיג מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה שיכולים להניב את מידת הפירוט המוורפולוגית הנחוצה לניתוח כמותי של התפלגות טרום-סינפטית, הכנת הדגימה האופטימלית היא קריטית. קיבעון כימי הוא הצעד הראשון בתהליך של הכנת הדגימה, ועל חשיבות עליונה כדי לשמור על מבנה בדיקת אולטרה. קיבוע כלי דם עם פתרון הגלוטאלדהיד-פורמלדהיד, ואחריו טיפול של דגימות הרטט מנות עם אוסמיום tetroxide, מייצב את המספר המרבי של מולקולות, בעיקר חלבונים ושומנים, ותוצאות שימור מעולה של מבנה האולטרה. הרקמה מעובדת לאחר מכן עם כתמים, התייבשות רציפה, שרף הטבעה. הגוש בלוקים עם אצטט uranyl (כלומר, כתמים של רקמת הרטט לפני הטבעה שרף) משפר את ניגודיות אנדוגניים ומייצב הרכיבים התא נגד החילוץ במהלך עיבוד הדגימה. ניגודיות יכולה להיות נוספת מוגברת על ידי החלת אצטט uranyl כמו כתם על מקטעים באולטראדקים. כתמים כפולים של סעיפים בודק עם עופרת ציטראט לאחר הטיפול uranyl אצטט גם משפר את רזולוציית התמונה, על ידי העצמת אלקטרון-אטימות של חומצות גרעין-המכיל מבנים באמצעות קשירה סלקטיבית של להוביל אצטט uranyl. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור הוא כלי רב עוצמה לאפיון הפרטים המיורפולוגיים של שלפוחיות סינפטית וקוונפיקציה של גודל וארגון מרחבי בבוטון. עם זאת, כיוון שהיא משתמשת ברקמה קבועה, מיקרוסקופ אלקטרוני שידור יכול לספק מידע עקיף רק לגבי תהליכים חיים או מתפתחים. לכן, יש לשקול טכניקות אחרות כאשר המטרה העיקרית היא ללמוד היבטים דינמיים או פונקציונליים של סחר שלפוחית סינפטית ואקסוציטוציטוזה.
Introduction
אנו מתארים שיטות להכנת רקמת המוח היילוד הנולד כדי להשיג מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה עבור ניתוח שורמטרי מעמיק של התפלגות מרחבית סינפטית ושלפוחית במסופים עצביים1,2. מיקרוגרפים בעלי ניגודיות גבוהה הניתנים להשגה על-ידי עיבוד דגימות בעקבות שיטות אלה ניתן להשתמש גם כדי ללמוד את המבנה המפורט של מספר רכיבים סלולריים ויחסי מבניים תלת-ממדיים שלהם3,4.
מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM) הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד את המבנה של האורגלים ומבנים סלולריים אחרים כימות. נכון לעשור זה, אין שיטות חקירה אחרות שיכולות לספק את אותה מידת הרזולוציה של קרום השומנים והאורגלים ללא התיוג האנטי-אימונו, למעט הקריוקיבעון באמצעות קיפאון בלחץ גבוה. עם זאת, הקפאת טכניקות החלפה אינן בשימוש נרחב, ובדרך כלל דורשים ציוד יקר וזמני הכנה ארוכה.
כדי לנצל את הכוח לפתרון גבוה של TEM, הכנת הדגימה אופטימלית היא בעלת חשיבות עליונה. המטרות העיקריות של הכנת הדגימה הם לשמר מבנה רקמות עם שינוי מינימלי ממצב החיים, לשפר את הניגודיות הדגימה, ולייצב את הרקמה נגד הפקת רכיבים סלולריים במהלך עיבוד וחשיפה לאלקטרון קרן. פרוטוקולים רבים עבור הכנה רקמת TEM הוכנסו ושכללו על ידי מעבדות מספר במהלך השנים. רבים מהם התמקדו בשיטות להדמיה אופטימלית של שלפוחית הסינפטית5,6,7,8,9,10,11. בין מספר שיטות שנקבעו היטב, תקן זהב כיום בשימוש, בחרנו הליכי קיבוע כימיים, קיבוע קיבעון, בלוק כתמים, התייבשות סדרתית, שרף הטבעה ולאחר צביעת המטרה לשמר את מבנה הרקמה אופטימלית להשיג ניגודיות תמונה מעולה. של הערה, שימור של מבנה בדיקת אולטרה יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר עובד עם רקמת המוח היילוד. למעשה, מערכת העצבים המרכזית של בעלי חיים צעירים מאוד מתאפיינת בתוכן מים גבוה יותר מאשר המוח המבוגר, התרחבות בולטת יותר של חללים מחלתיים, וקשרים משוחררים בין תאים12. זה הופך את רקמת המוח הנולד היילוד רגיש עמוקות לשינויים באוסמלתיים, ונוטה להפליא הצטמקות העובדתית ו/או נפיחות כאשר מעובד באמצעות פתרונות רציפים של גוונים שונים12. לכן, השיטות שלנו המועסקים פתרונות עבור עיבוד דגימה כי הם של האוסמלכי קרוב ככל האפשר זה של המוח הנולד החולדה. המטרה שלנו היתה להשיג תמונות באיכות גבוהה, ברזולוציה גבוהה אלקטרון מיקרוסקופ עבור הערכה כמותית של התפלגות סינפטית ושלפוחית מרחבית במסופי העצבים. במיוחד, ביקשו למדוד את מספר השלפוחיות בתוך מסוף העצבים, את המרחק של שלפוחיות סינפטית מקרום פלזמה טרום סינפטית, מספר שלפוחיות מעוגן בקרום טרום סינפטית, בגודל של שלפוחיות סינפטית וה מרחקים בין-שלפוחית1.
קיבעון כימי משביע רצון הוא תנאי הכרחי להשגת מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה שיכולים לספק את הפרטים המיקרוורפולוגיים הנחוצים לחקר המבנה הסינפטית והארגון המרחבי. למרות מספר מצבים של קיבעון להתקיים, קיבעון של רקמת המוח על ידי זלוף כלי דם הוא בהחלט מעולה על שיטות אחרות. כיוון שקיבעון באמצעות פרזיה וסקולרית מתחיל מיד לאחר מעצרו של מחזור מערכתי, הוא מקצר את המרווח בין הדחמצן של רקמת המוח והקישור החוצה של חלבונים עם fixatives וכתוצאה מכך שינויים מינימליים בתא בנה. יתר על כן, זה משיגה חדירה מהירה ואחידה, בגלל הזרימה המהירה של הקיבעון מן המיטה כלי הדם אל המלושה תאים סלולריים12,13,14. הקיבעון הראשוני עם glutarאלדהיד, ואחריו קיבעון משני (פוסט קיבעון) עם אוסמיום tetroxide, תשואות מעולה של המבנה המשובח15,16,17. תערובת של גלוטרלדהיד ו פאראפורמלדהיד יש יתרון נוסף של חדירה מהירה יותר לתוך הרקמה12.
מאחר שרקמות ביולוגיות אינן נוקשות מספיק כדי לחתוך לחלקים דקים ללא תמיכה של מטריצה שרף, הם צריכים להיות מוטבע בתוך מדיום לפני דק. Immiscible מים שרפים אפוקסי משמשים בדרך כלל כמדיום הטבעה ב TEM. כאשר סוג זה של מטריצה משמש, כל המים חינם של הדגימה חייב להיות מוחלף ממס אורגני לפני הסתננות שרף. המים מוסרים על ידי העברת הדגימה דרך סדרה של פתרונות של ריכוזים עולים של אתנול ו/או אצטון12. בפרוטוקול זה, דגימות הן השטוח הראשון המוטבע בין גיליונות aclar גמישים, ולאחר מכן מוטבע בקפסולה. התוצאה הסופית היא רקמה ממוקמת בקצה של בלוק שרף גלילי, אשר יש את הגיאומטריה האידיאלית להיות מושפע לפחות על ידי תנודות הנובעות במהלך החסימה מיקרוטומה.
כתמים עם מתכות כבדות כדי לשפר את הניגודיות רקמת אנדוסוגני הוא היבט חשוב אחר של הכנת הדגימה. ניגודיות תמונה ב-TEM נובעת מפיזור אלקטרון על ידי האטומים ברקמה. עם זאת, חומרים ביולוגיים מורכבים ברובו מולקולות של משקל אטומי נמוך (כלומר, פחמן, מימן, חמצן וחנקן). לפיכך, הדור של ניגוד פיזור מספיק דורש התאגדות של אטומי משקל אטומי גבוה לתוך הרכיבים הסלולריים של הרקמה. זה מושג באמצעות כתמים של הדגימה עם מתכות כבדות12,18,19. Osmium tetroxide, אורניום ועופרת, אשר לאגד חזק לשומנים, הם המתכות הכבדות הנפוצות ביותר המשמשים כתמי אלקטרונים.
אוסמיום (מספר אטומי 76) הוא אחד מהמתכות הדפססט ביותר הקיימות. זה גם קבע וגם כתם, למרות תפקידה העיקרי ב TEM הוא כמו קבע אמינה12. בין פרוטוקולי קיבוע שונים בשימוש, השיטה של קיבעון כפול עם glutarאלדהיד ואחריו אוסמיום הוא היעיל ביותר בהפחתת החילוץ של המרכיבים התא במהלך הכנת הדגימה. שני התיקונים הללו משמשים לייצוב המספר המירבי של סוגים שונים של מולקולות, במיוחד חלבונים ושומנים, ולגרום לשימור מעולה של מבנה הרקמה12,14,15, מיכל בן 16 , . שבע עשרה
אורניום (מספר אטומי 92) הוא המתכת הכבדים ביותר המשמשת ככתם אלקטרוני, בדרך כלל בצורה של אצטט uranyl. בדומה לאוסמיום, היא משמשת ככתם ומfixative, למרות שתפקידה העיקרי ב-TEM הוא ככתם20,21. חומצות גרעין המכילים ו קרומי מבנים הם באופן מאוד ומהנה מוכתם עם מלחים uranyl ב אלדהיד-קבוע רקמות22,23. טיפול ברקמות עם אצטט uranyl לאחר osmication ולפני התייבשות תוצאות ייצוב של קרומי ו גרעין חומצות המכילות מבנים, כמו גם ניגודיות משופרת, והיתרי זיהוי של כמה פרטים מבניים שלא להיות מזוהה בקלות בדגימות ויטראז ‘ עם אוסמיום לבד12,24,25. הוא חשב כי אצטט uranyl יכול לייצב את המבנה המשובח על ידי שילוב עם אוסמיום מופחת כי כבר הופקד על ממברנות שומנים במהלך osmication24. הניגודיות המירבית מושגת כאשר אצטט uranyl מוחל לפני הטבעה כמו לאחר כתם בסעיפים דקים12.
עופרת (מספר אטומי 82) הוא הכתם השכיח ביותר המשמש עבור TEM והוא מועסק בעיקר עבור לאחר כתמי של סעיפים דקים. מלחי עופרת יש אטימות אלקטרון גבוהה ולהראות אהדה עבור מגוון רחב של מבנים סלולריים, כולל ממברנות, חלבון cytoplasmic חלבונים, חומצות גרעין וגליקוגן26,27. כאשר שיטת הצביעה כפול מועסק (כלומר, כתמים עם אצטט uranyl מלווה בטיפול עם העופרת), האחרון משמש כמפתח של כתמים אצטט uranyl. למשל, עופרת לאחר צביעת כרומטין קבוע עם glutarאלדהיד מגביר את uranyl אצטט ספיגה על ידי פקטור של שלושה28,29,30,31,32. עופרת גם מגביר את הצביעת הניתן על ידי מתכות אחרות כגון osmium. הוא חשב כי מלחים עופרת להכתים את הקרומים של אוסממיום רקמות קבוע על ידי הצמדת לקבוצת הקוטב של פוספהדים בנוכחות של אוסמיום מופחת33. חיסרון פוטנציאלי של הכתמים עם אצטט uranyl ולהוביל, במיוחד עבור משכים ממושכת, הוא כי רכיבים רבים שונים מבניים מוכתם באופן שווה ולא במיוחד, ולכן לא ניתן להבדיל בקלות אחד מהשני12 .
המבוא האחרון של מקורות אור חלופיים, כגון במיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה של תמונה מופעלת, השתפרה באופן משמעותי ברזולוציה מיקרוסקופ אור34. עם זאת, משום שמיקרוסקופ האור מסתמך על שיטות היסטכימיות והחיסונית-ציטוכימיה להמחיש באופן אינדיבידואלי חלבונים או אנזימים, הכוח של TEM להציג את כל האלמנטים מבניים בו נשאר מתחרות למחקר מעמיק של ה מורפולוגיה ויחסים ממדיים של מבני רקמה. במיוחד, אין טכניקה אחרת יכול לספק את הפרטים מורפולוגיים הדרושים כדי לבצע ניתוח מורמטרי של הפצת שלפוחית סינפטית סינפטיות בתוך בלוני עצבים טרום סינפטית. עם זאת, חשוב לציין כי מיקרוגרפים אלקטרונים ללכוד את מבנה הרקמה לאחר האורגניזם מת, ולכן הם לא יכולים לספק מידע לגבי הדינמיקה של סחר טרום סינפטית והיא האקסוציטוזה. מכאן, כלים אחרים, כגון הדמיה לחיות צבע FM ו תיקון-קלאמפ מהדק, צריך להיחשב כאשר המטרה העיקרית היא ללמוד דינמי ו/או פונקציונלי היבטים של סחר שלפוחית סינפטית ואקסוציטוזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
טיפול בחתכי רקמה במהלך הכנת הדגימה עבור TEM דורש מידה ניכרת של עידון, ריכוז וסבלנות. כאשר משתמשים במיקרופיפטה כדי להוסיף ולהסיר פתרונות, ניתן למצוץ דגימות לתוך העצה מפני פני השטח, ולכן יש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע נזק לרקמות על ידי הצנרת. גם, צעדים מסוימים של רצף התייבשות יכול להיות מהיר כמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כתב יד זה נתמך על ידי NIH/כK08 MS 123321 (כדי N.L.) ועל ידי כספים של המחלקה למהרדמה באוניברסיטת וירג. המחברים רוצים להודות לאלייב ריסיר (מחלקת הביולוגיה, אוניברסיטת וירג, שרלוטסוויל, VA) להכשרה מעולה וסיוע טכני עם TEM, וביקורת על כתב היד שלה לא יסולא בפז. המחברים מודים גם בפני מתקן אלקטרון מתקדם באוניברסיטת וירג לקבלת סיוע טכני באמצעות דגימה ולאחר כתמים.
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C., Santini, M. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
- Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
