ونحن وصف إجراءات لمعالجه انسجه المخ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الدقة لتحليل مورفرومتري من توزيع الحويصلات متشابك في المحطات العصبية. الرسوم البيانية التي تم الحصول عليها مع هذه الأساليب يمكن أيضا ان تستخدم لدراسة المورفولوجية لعدد من المكونات الخلوية الأخرى وعلاقتاتها الهيكلية الابعاد.
وقد استغل مختبرنا وغيرها الكثير من قوه حل عاليه من انتقال المجهر الكترون لدراسة المورفولوجية والتنظيم المكاني من الحويصلات متشابك. من أجل الحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الجودة التي يمكن ان تسفر عن درجه من التفاصيل المورفولوجية اللازمة للتحليل الكمي للتوزيع قبل متشابك الحويصلة ، اعداد العينة الأمثل أمر بالغ الاهميه. التثبيت الكيميائي هو الخطوة الاولي في عمليه اعداد العينات ، وذات اهميه قصوى للحفاظ علي البنية الدقيقة. تثبيت الاوعيه الدموية مع محلول الفورمالديهايد جلوتارالدهيد ، تليها معالجه العينات الذبذبات مع الاوزميوم tetroxide ، تستقر الحد الأقصى لعدد الجزيئات ، وخاصه البروتينات والدهون ، والنتائج في الحفظ المتفوق من البنية الفوقية. ثم تتم معالجه الانسجه مع المضادة للتلوين ، والجفاف متسلسلة والراتنج التضمين. ان تلطيخ كتله مع خلات اليورانيل (اي ، تلطيخ الانسجه الذبذبات الداخلية قبل التضمين الراتنج) يعزز التباين الذاتية وتستقر مكونات الخلية ضد الاستخراج اثناء معالجه العينات. ويمكن زيادة التباين من خلال تطبيق خلات اليورانيل كوصمه عار علي أقسام سامسونج. المزدوج تلطيخ المقاطع سامسونج مع سترات الرصاص بعد العلاج خلات اليورانيل يحسن أيضا دقه الصورة ، من خلال تكثيف الكترون التعتيم من الهياكل التي تحتوي علي حمض نووي من خلال ملزمه انتقائية من الرصاص إلى خلات اليورانيل. المجهر الكترون الإرسال هو أداه قويه لتوصيف التفاصيل المورفولوجية من الحويصلات متشابك والتقدير الكمي من حجمها والتنظيم المكاني في محطه بوتون. ومع ذلك ، لأنه يستخدم الانسجه الثابتة ، ونقل المجهر الكترون لا يمكن الا ان توفر معلومات غير مباشره فيما يتعلق بالحياة أو العمليات المتطورة. ولذلك ، ينبغي النظر في التقنيات الأخرى عندما يكون الهدف الرئيسي هو دراسة الجوانب الديناميكية أو الوظيفية لعمليات الاتجار بالحويصلات المتشابكة وندره المحببات.
ونحن وصف أساليب لاعداد انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الكترونات عاليه الجودة المجهرية للتحليل في العمق مورفمتري من التوزيع المكاني فيجليد متشابك في المحطات العصبية1،2. ويمكن أيضا استخدام الرسومات المجهرية عاليه التباين التي يمكن الحصول عليها من خلال معالجه العينات بعد هذه الطرق لدراسة المورفولوجية التفصيلية لعدد من المكونات الخلوية وعلاقتاتها الهيكلية الابعاد3,4.
المجهر الكترون الإرسال (TEM) هو أداه قويه لدراسة المورفولوجية من العضيات وغيرها من الهياكل الخلوية كميا. اعتبارا من هذا العقد ، لا توجد طرق أخرى للتحقيق التي يمكن ان توفر نفس الدرجة من القرار من الاغشيه الدهنية والعضوية بدون وضع العلامات المناعية ، باستثناء كريوفيكسيشن بالضغط العالي التجميد. ومع ذلك ، لا تستخدم تقنيات استبدال التجميد علي نطاق واسع ، وتتطلب عاده معدات باهظه الثمن وأوقات اعداد طويلة.
من أجل الاستفادة من قوه الحل العالية لل TEM ، يعد الاعداد الأمثل للعينه أمرا بالغ الاهميه. الأهداف الرئيسية لاعداد العينات هي الحفاظ علي بنيه الانسجه مع الحد الأدنى من التغيير من الدولة الحية ، وتعزيز النقيض من العينة ، واستقرار الانسجه ضد استخراج المكونات الخلوية اثناء المعالجة والتعرض للكترون شعاع. وقد أدخلت العديد من البروتوكولات لاعداد الانسجه TEM والكمال من قبل العديد من المختبرات علي مر السنتين. وقد ركزت العديد منهم علي أساليب التصور الأمثل من الحويصلات متشابك5,6,7,8,9,10,11. من بين عدد من الأساليب الراسخة ، والذهب القياسية المستخدمة حاليا ، اخترنا إجراءات لتثبيت الكيميائية ، وتثبيت وظيفة ، وتلطيخ كتله ، والجفاف متسلسلة ، وتضمين الراتنج واخر تلطيخ التي تهدف إلى الحفاظ علي هيكل الانسجه الأمثل تحقيق التباين صوره ممتازة. من الملاحظة ، يمكن ان يكون الحفاظ علي البنية الدقيقة صعبا بشكل خاص عند العمل مع انسجه المخ الفئران حديثي الولادة. في الواقع ، يتميز الجهاز العصبي المركزي للحيوانات الصغيرة جدا بمحتوي المياه اعلي من الدماغ الكبار ، وتوسيع أكثر بروزا من المساحات خارج الخلية ، والاتصالات أكثر مرونة بين الخلايا12. وهذا يجعل انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة حساسة للغاية للتغيرات في osmolarity ، وعرضه بشكل رائع لانكماش الارتيقيه و/أو تورم عند معالجتها من خلال حلول متسلسلة من قوه انقباض مختلفه12. ولذلك ، استخدمت أساليبنا الحلول لمعالجه العينات التي هي من الاسموليه أقرب ما يمكن إلى ان من الفئران الوليد الدماغ. وكان هدفنا الحصول علي صور عاليه الجودة وعاليه الدقة المجهر الكتروني للتقييم الكمي للتوزيع المكاني لحويصلات متشابك في المحطات العصبية. علي وجه التحديد ، سعينا لقياس عدد الحويصلات داخل المحطة العصبية ، والمسافة من الحويصلات متشابك من غشاء البلازما قبل متشابك ، وعدد من الحويصلات رست في الغشاء قبل متشابك ، وحجم الحويصلات متشابك المسافات بين الحويصلات1.
التثبيت الكيميائي المرضي هو شرط أساسي للحصول علي الرسوم المجهرية الكترون عاليه الجودة التي يمكن ان توفر التفاصيل المورفولوجية اللازمة لدراسة التشكل الحويصلة المتشابكة والتنظيم المكاني. علي الرغم من وجود عده طرق للتثبيت, تثبيت انسجه المخ عن طريق التروية الوعائية هو بالتاكيد متفوقة علي أساليب أخرى. منذ التثبيت عن طريق التروية الوعائية يبدا مباشره بعد إلقاء القبض علي الدورة الدموية الجهازية ، فانه يقصر الفاصل الزمني بين الاكسده من انسجه المخ وعبر ربط البروتينات مع المثبتات ، مما ادي إلى الحد الأدنى من التعديلات في الخلية هيكل. وعلاوة علي ذلك ، فانه يحقق اختراق سريع وموحد ، وذلك بسبب التدفق السريع من المثبت من سرير الاوعيه الدموية إلى المقصورات خارج الخلية والخلوية12،13،14. التثبيت الاولي مع غلوتارالديهيد ، تليها التثبيت الثانوي (بعد التثبيت) مع الاوزميوم tetroxide ، غله ممتازة الحفاظ علي هيكل غرامه15،16،17. مزيج من غلوتارالديهيد وبارافورمالدهيد لديه ميزه اضافيه لاختراق أكثر سرعه في الانسجه12.
نظرا لان الانسجه البيولوجية ليست جامده بما فيه الكفاية ليتم قطعها إلى أقسام رقيقه دون دعم مصفوفة الراتنج ، فانها تحتاج إلى ان تكون جزءا لا يتجزا في وسط قبل التقطيع رقيقه. المياه-immiscible راتنجات الايبوكسي تستخدم عاده كوسيلة التضمين في TEM. عند استخدام هذا النوع من المصفوفة ، يجب استبدال جميع المياه المجانية للعينه بمذيب عضوي قبل تسلل الراتنج. يتم أزاله المياه عن طريق تمرير العينة من خلال سلسله من الحلول لتركيزات تصاعدية من الايثانول و/أو الأسيتون12. في هذا البروتوكول ، والعينات هي أول شقه جزءا لا يتجزا بين أوراق aclar مرنه ، ثم جزءا لا يتجزا في كبسوله. والنتيجة النهائية هي الانسجه التي تقع في طرف كتله الراتنج أسطواني ، والتي لديها الهندسة المثالية لتكون اقل تاثرا بالاهتزازات الناشئة خلال ميكروتومي التماس.
تلطيخ مع المعادن الثقيلة لتعزيز التباين الانسجه الذاتية هو جانب آخر مهم من اعداد العينة. ويرجع تباين الصورة في TEM إلى تشتت الكترونات بواسطة الذرات في الانسجه. ومع ذلك ، تتكون المواد البيولوجية إلى حد كبير من جزيئات منخفضه الوزن الذري (اي الكربون والهيدروجين والأكسجين والنيتروجين). ولذلك ، فان توليد تباين التشتت الكافي يتطلب دمج ذرات الوزن الذري العالية في المكونات الخلوية للانسجه. ويتحقق ذلك من خلال تلطيخ العينة مع المعادن الثقيلة12،18،19. الاوزميوم tetroxide ، واليورانيوم والرصاص ، والتي تربط بقوة للدهون ، هي المعادن الثقيلة الأكثر شيوعا المستخدمة كبقع الكترون.
الاوزميوم (الرقم الذري 76) هي واحده من المعادن الأكثر كثافة في الوجود. وهو علي حد سواء المثبت ووصمه عار, علي الرغم من ان دورها الأساسي في TEM كما هو مثبت موثوق12. من بين بروتوكولات التثبيت المختلفة في الاستخدام ، وطريقه التثبيت المزدوج مع غلوتارالديهيد تليها الاوزميوم هو الأكثر فعاليه في الحد من استخراج مكونات الخلية اثناء اعداد العينة. وتستخدم هذه المثبتات اثنين لتحقيق الاستقرار في الحد الأقصى لعدد من أنواع مختلفه من الجزيئات ، وخاصه البروتينات والدهون ، ويؤدي إلى الحفاظ علي متفوقة من الانسجه البنية العالية12،14،15، 16 , السابعة عشره
اليورانيوم (الرقم الذري 92) هو أثقل المعادن المستخدمة كبقعه الكترون ، ومعظمها عاده في شكل خلات اليورانيل. بالمثل إلى الاوزميوم, يتصرف هو بما ان وصمه عار ومثبت, رغم ان دوره أساسيه في [تيم] كوصمه عار20,21. الأحماض النووية التي تحتوي علي والهياكل غشائي ملطخه بشده وبشكل تفضيلي مع أملاح اليورانيل في الدهيد-الانسجه الثابتة22،23. علاج الانسجه مع خلات اليورانيل بعد osmication وقبل الجفاف يؤدي إلى استقرار غشائي والبني التي تحتوي علي الأحماض النووية ، فضلا عن التباين المعزز ، ويسمح بتحديد بعض التفاصيل الهيكلية التي لن يمكن الكشف عنها بسهوله في عينات ملطخه الاوزميوم وحدها12،24،25. ويعتقد ان خلات اليورانيل قد استقرار هيكل غرامه من خلال الجمع بين مع انخفاض الاوزميوم التي تم إيداعها علي اغشيه الدهون خلال osmication24. ويتحقق الحد الأقصى من التباين عندما يتم تطبيق خلات اليورانيل قبل تضمينها وباعتبارها بعد وصمه عار في المقاطع رقيقه12.
الرصاص (الرقم الذري 82) هو وصمه عار الأكثر شيوعا المستخدمة لل TEM ويستخدم أساسا لما بعد تلطيخ من أقسام رقيقه. أملاح الرصاص لديها التعتيم الكترون عاليه وإظهار تقارب لمجموعه واسعه من الهياكل الخلوية ، بما في ذلك الاغشيه والبروتينات النووية والخلوية ، والأحماض الامينيه والجليكوجين26،27. عندما يتم استخدام طريقه تلطيخ مزدوجة (اي ، تلطيخ مع خلات اليورانيل متبوعا بالعلاج مع الرصاص) ، وهذا الأخير بمثابه مطور من تلطيخ خلات اليورانيل. علي سبيل المثال ، يؤدي بعد تلطيخ الكروماتين الثابتة مع غلوتارالديهيد يزيد امتصاص اليورانيل خلات بعامل من ثلاثه28، 29،30،31،32. الرصاص يعزز أيضا تلطيخ المنقولة من المعادن الأخرى مثل الاوزميوم. ويعتقد ان الأملاح الرصاص وصمه عار الاغشيه من الانسجه الاوزميوم الثابتة عن طريق ربط للمجموعة القطبية من الفوسفاتيدات في وجود انخفاض الاوزميوم33. عيب محتمل من تلطيخ مع كل من خلات اليورانيل والرصاص ، وخاصه بالنسبة لفترات طويلة ، هو ان العديد من العناصر الهيكلية المختلفة ملطخه بالتساوي وغير علي وجه التحديد ، التالي قد لا يكون من السهل تمييزها عن بعضها البعض12 .
الإدخال الأخير لمصادر الضوء البديلة ، مثل المجهر الضوئي البصري فائق الدقة المنشط للصور ، قد تحسن بشكل كبير من دقه المجهر الضوئي34. ومع ذلك ، نظرا لان المجهر الضوئي يعتمد علي الطرق الكيميائية النسيجية والمناعية-الكيميائية لتصور البروتينات أو الانزيمات الموسومة بشكل فردي ، فان قوه TEM لعرض جميع العناصر الهيكلية في ان واحد تبقي غير مسبوقة للدراسة المتعمقة علاقات المورفولوجية والابعاد لهياكل الانسجه. علي وجه الخصوص ، لا يمكن لأي تقنيه أخرى توفير التفاصيل المورفولوجية اللازمة لاجراء تحليل مورفرومتري من توزيع الحويصلات متشابك في العصب العصبي قبل متشابك. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان الرسوم المجهرية الكترون التقاط هيكل النسيج بعد وفاه الكائن الحي ، التالي فانها لا يمكن ان توفر معلومات بشان ديناميات الاتجار بالحويصلات قبل متشابك والانتشار. التالي, أدوات أخرى, مثل التصوير الحية FM صبغ والتصحيح المشبك الكهربائية, وينبغي النظر عندما يكون الهدف الرئيسي هو دراسة الجوانب الحيوية و/أو الوظيفية من الاتجار بالحويصلات متشابك وكثرة المحببات.
التعامل مع أقسام الانسجه اثناء اعداد العينات لل TEM يتطلب درجه كبيره من البراعة والتركيز والصبر. عند استخدام الماصات المجهرية لأضافه المحاليل وأزالها ، يمكن امتصاص العينات في طرف الماصة عن طريق التوتر السطحي ، لذا ينبغي توخي الحذر الشديد لتجنب تلف الانسجه بواسطة الماصة. أيضا ، خطوات معينه …
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه المخطوطة من قبل المعاهد القومية للصحة/NIGMS K08 123321 (إلى N.L.) وباموال من قسم التخدير في جامعه فيرجينيا. ويود المؤلفون ان يشكروا السيد ايليف (قسم علم الاحياء ، جامعه فرجينيا ، شارلوتسفيل ، VA) علي التدريب الممتاز والمساعدة التقنية مع TEM ، وعلي انتقاداتها التي لا تقدر بثمن. ويشكر المؤلفون أيضا مرفق المجهر الكتروني المتقدم في جامعه فرجينيا للحصول علي المساعدة التقنية مع العينات والتقطيع وما بعد التلطيخ.
4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |