Voorbereiding van pasgeboren rat hersenweefsel voor Ultrastructurele Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals
Summary
Wij beschrijven procedures voor de verwerking van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen hoge-resolutie elektronen micrografen voor Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals. De met deze methoden verkregen micrografen kunnen ook gebruikt worden om de morfologie van een aantal andere cellulaire componenten en hun dimensionale structurele relaties te bestuderen.
Abstract
Ons laboratorium en vele anderen hebben de hoge oplossende kracht van transmissie elektronenmicroscopie benut om de morfologie en ruimtelijke ordening van synaptische blaasjes te bestuderen. Voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige elektronen micrografen die de mate van morfologische details die nodig zijn voor de kwantitatieve analyse van pre-synaptische blaasje distributie kan opleveren, is een optimale specimen voorbereiding van cruciaal belang. Chemische fixatie is de eerste stap in het proces van het specimen voorbereiding, en van het allergrootste belang voor het behoud van fijne fijnstructuur. Vasculaire fixatie met een glutaraldehyde-formaldehydeoplossing, gevolgd door de behandeling van vibratome specimens met osmium tetroxide, stabiliseert het maximum aantal moleculen, met name eiwitten en lipiden, en resulteert in een superieure instandhouding van fijnstructuur. Weefsel wordt vervolgens verwerkt met counterstaining, sequentiële uitdroging en hars-inbedding. En bloc kleuring met uranyl acetaat (dat wil zeggen, kleuring van vibratome weefsel voor hars inbedding) verbetert endogene contrast en stabiliseert cel componenten tegen extractie tijdens het monster verwerking. Contrast kan verder worden verhoogd door het toepassen van uranyl acetaat als een post-vlek op ultradunne secties. Dubbel-kleuring van ultradunne secties met lood citraat na uranyl acetaat behandeling verbetert ook de beeldresolutie, door het intensiveren van elektronen-opaciteit van nucleïnezuur-bevattende structuren door middel van selectieve binding van lood tot uranyl acetaat. Transmission Electron microscopie is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van de morfologische Details van synaptische blaasjes en kwantificering van hun grootte en ruimtelijke organisatie in de Terminal Bouton. Echter, omdat het gebruik maakt van vaste weefsels, transmissie elektronenmicroscopie kan alleen indirect informatie over levende of evoluerende processen. Daarom moeten andere technieken worden overwogen wanneer de belangrijkste doelstelling is het bestuderen van dynamische of functionele aspecten van de synaptische blaasje handel en exocytose.
Introduction
We beschrijven methoden voor de bereiding van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen van hoge kwaliteit elektronen micrografen voor diepgaande Morphometric analyse van de synaptische blaasje ruimtelijke verdeling bij zenuw terminals1,2. De High-contrast-micrografen die kunnen worden verkregen door de verwerking van specimens naar aanleiding van deze methoden kan ook worden gebruikt om de gedetailleerde morfologie van een aantal cellulaire componenten en hun dimensionale structurele relaties te bestuderen3,4.
De Transmission Electron Microscoop (TEM) is een krachtig instrument om de morfologie van organellen en andere cellulaire structuren kwantitatief te bestuderen. Vanaf dit decennium, zijn er geen andere methodes van onderzoek die de zelfde graad van resolutie van lipide membranen en organellen zonder immuun-tagging, met uitzondering van cryofixation door hoge druk het bevriezen kunnen verstrekken. Echter, bevriezing substitutie technieken zijn niet op grote schaal gebruikt, en normaalgesproken dure apparatuur en lange voorbereiding tijden.
Om gebruik te kunnen maken van de hoge oplossings kracht van TEM is een optimale specimen voorbereiding van het allergrootste belang. De belangrijkste doelstellingen van specimen voorbereiding zijn weefselstructuur met minimum wijziging van de het leven staat te bewaren, specimen contrast te verbeteren, en het weefsel tegen extractie van cellulaire componenten tijdens verwerking en blootstelling aan het elektron te stabiliseren Beam. Talrijke protocollen voor de voorbereiding van de TEM-weefsels zijn door de jaren heen geïntroduceerd en geperfectioneerd door verschillende laboratoria. Velen van hen hebben zich geconcentreerd op methoden voor een optimale visualisatie van synaptische blaasjes5,6,7,8,9,10,11. Onder een aantal gevestigde, goudstandaard methoden die momenteel in gebruik zijn, kozen we voor de procedures voor chemische fixatie, post fixatie, en bloc kleuring, sequentiële uitdroging, hars inbedding en post kleuring die gericht zijn op het behoud van optimale weefselstructuur en uitstekende beeldcontrast te bereiken. Van de nota, het behoud van fijne fijnstructuur kan bijzonder uitdagend zijn bij het werken met pasgeboren rat hersenweefsel. In feite is het centrale zenuwstelsel van zeer jonge dieren wordt gekenmerkt door een hoger watergehalte dan de volwassen hersenen, meer prominente uitbreiding van de extracellulaire ruimten, en losser verbindingen tussen de cellen12. Dit maakt pasgeboren rat hersenweefsel diep gevoelig voor veranderingen in osmolariteit, en prachtig vatbaar voor artefactuele krimp en/of zwelling bij verwerking door middel van sequentiële oplossingen van verschillende tonicity12. Daarom werkten onze methodes oplossingen voor specimen verwerking die van osmolariteit zo dicht mogelijk aan dat van Rat pasgeboren hersenen zijn. Ons doel was om hoge kwaliteit, hoge-resolutie elektronenmicroscopie beelden voor kwantitatieve beoordeling van de synaptische blaasje ruimtelijke verdeling bij zenuw terminals te verkrijgen. Concreet wilden we het aantal blaasjes meten in de zenuw Terminal, de afstand van synaptische blaasjes uit de pre-synaptische plasmamembraan, het aantal blaasjes gedokt op de pre-synaptische membraan, de grootte van synaptische blaasjes en de Inter-blaasje afstanden1.
Bevredigende chemische fixatie is een voorwaarde voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige elektronen micrografen die de morfologische details die nodig zijn om synaptische blaasje morfologie en ruimtelijke organisatie te bestuderen kan bieden. Hoewel er verschillende wijzen van fixatie bestaan, fixatie van hersenweefsel door vasculaire bloeding is beslist superieur aan andere methoden. Aangezien fixatie via vasculaire bloeding onmiddellijk na de arrestatie van de systemische circulatie begint, verkort het interval tussen ontzuuring van het hersenweefsel en cross-linking van eiwitten met Fixatieven, wat resulteert in minimale veranderingen in de cel Structuur. Bovendien verwezenlijkt het snelle en eenvormige penetratie, wegens de snelle stroom van fixatief van het vasculaire bed aan de extracellulaire en cellulaire compartimenten12,13,14. Primaire fixatie met glutaraldehyde, gevolgd door secundaire fixatie (post-fixatie) met osmium tetroxide, levert een uitstekende bewaring van de fijne structuur15,16,17. Een mengsel van glutaraldehyde en Paraformaldehyde heeft het extra voordeel van snellere penetratie in weefsel12.
Aangezien de biologische weefsels niet voldoende stijf zijn om in dunne secties zonder de steun van een hars matrijs worden gesneden, moeten zij in een middel vóór dunne sectie worden ingebed. Water-onmengbare epoxyharsen worden vaak gebruikt als een inbedding medium in TEM. Wanneer dit type van matrijs wordt gebruikt, moet het vrije water van het specimen met een organisch oplosmiddel vóór hars infiltratie worden vervangen. Water wordt verwijderd door het passeren van het specimen door middel van een reeks van oplossingen van stijgende concentraties van ethanol en/of aceton12. In dit protocol, zijn de specimens eerste vlak ingebed tussen flexibele aclar bladen, dan ingebed in een capsule. Het uiteindelijke resultaat is weefsel gelegen op het puntje van een cilindrische hars blok, die de ideale geometrie te zijn minst beïnvloed door trillingen die zich voordoen tijdens microtome sectie.
De kleuring met zware metalen om endogene weefsel contrast te verbeteren is een ander belangrijk aspect van specimen voorbereiding. Beeldcontrast in TEM is te wijten aan elektronen verstrooiing door de atomen in het weefsel. Echter, biologische materialen bestaan grotendeels uit een laag atoomgewicht moleculen (dwz koolstof, waterstof, zuurstof en stikstof). Daarom vereist de generatie van voldoende verstrooiend contrast de opneming van hoge atoomgewicht atomen in de cellulaire componenten van het weefsel. Dit wordt bereikt door het bevlekken van het specimen met zware metalen12,18,19. Osmium tetroxide, uranium en lood, die sterk aan lipiden binden, zijn de gemeenschappelijkste zware metalen die als elektronen vlekken worden gebruikt.
Osmium (atoomnummer 76) is een van de dichtste metalen in het bestaan. Het is zowel een fixatief en een vlek, hoewel de primaire rol in TEM is als een betrouwbare fixatief12. Onder verschillende fixatie protocollen in gebruik, de methode van dubbele fixatie met glutaraldehyde gevolgd door osmium is het meest effectief in het verminderen van de extractie van cel bestanddelen tijdens het monster voorbereiding. Deze twee Fixatieven worden gebruikt om het maximum aantal verschillende types van molecules, vooral proteïnen en lipiden te stabiliseren, en resulteren in het superieure behoud van weefsel fijnstructuur12,14,15, 16 , 17.
Uranium (atoomnummer 92) is het zwaarste metaal dat gebruikt wordt als elektron vlek, meestal in de vorm van uranyl acetaat. Evenzo om osmium, het fungeert als een vlek en fixatief, hoewel de primaire rol in tem is als een vlek20,21. De nucleïnezuur-bevattende en membranous structuren zijn sterk en bij voorkeur bevlekt met uranyl zouten in aldehyde-vaste weefsels22,23. Behandeling van weefsels met uranyl acetaat na osmication en voor uitdroging resulteert in stabilisatie van membranous en nucleïnezuur-bevattende structuren, evenals een verhoogd contrast, en vergunningen identificatie van een aantal structurele details die niet zou gemakkelijk worden gedetecteerd in specimens gekleurd met osmium alleen12,24,25. Men denkt dat uranyl acetaat de fijne structuur kan stabiliseren door met verminderde osmium te combineren die op lipide membranen tijdens osmication24is gedeponeerd. Maximaal contrast wordt bereikt wanneer uranyl acetaat wordt toegepast voordat inbedding en als een post-vlek in dunne secties12.
Lood (atoomnummer 82) is de meest voorkomende vlek gebruikt voor TEM en is voornamelijk werkzaam voor post-kleuring van dunne secties. Loodzouten hebben een hoge elektronen opaciteit en tonen affiniteit voor een breed scala van cellulaire structuren, met inbegrip van membranen, nucleaire en cytoplasma eiwitten, nucleïnezuren en glycogeen26,27. Wanneer de dubbele kleuring methode wordt gebruikt (dat wil zeggen, kleuring met uranyl acetaat wordt gevolgd door een behandeling met lood), de laatste fungeert als een ontwikkelaar van uranyl acetaat kleuring. Bijvoorbeeld, lood post-kleuring van Chromatin vast met glutaraldehyde verhoogt uranyl acetaat opname met een factor van drie28,29,30,31,32. Lood verbetert ook de kleuring bijbrengen door andere metalen, zoals osmium. Men denkt dat loodzouten vlek de membranen van osmium weefsels door aan de polaire groep fosfatiden in aanwezigheid van verminderde osmium33te bevestigen. Een potentieel nadeel van kleuring met zowel uranyl acetaat en lood, vooral voor langdurige duur, is dat veel verschillende structurele elementen zijn gelijkmatig gekleurd en niet-specifiek, en kan dus niet gemakkelijk worden onderscheiden van elkaar12 .
De recente introductie van alternatieve lichtbronnen, zoals in optische super-resolution Photo-activated localization microscopie, heeft een significant verbeterde Lichtmicroscopie resolutie34. Omdat de Lichtmicroscopie echter gebaseerd is op Histochemical en immuun-cytochemische methoden om individueel gelabelde eiwitten of enzymen te visualiseren, blijft de kracht van TEM om alle structurele elementen in één keer weer te geven ongeëvenaard voor een grondige studie van de morfologie en dimensionale relaties van weefsel structuren. In het bijzonder, kan geen andere techniek de morfologische Details verstrekken noodzakelijk om Morphometric analyse van synaptische blaasje distributie bij pre-synaptische zenuw boutons uit te voeren. Niettemin, is het belangrijk om op te merken dat de elektronen micro grafieken de structuur van het weefsel na het organisme overlijdt vangen, en daarom kunnen zij informatie betreffende de dynamica van pre-synaptische blaasje handel en exocytose niet verstrekken. Vandaar, zouden andere hulpmiddelen, zoals de kleurstof van de FM-levende weergave en flard-klem elektrofysiologisch, moeten worden overwogen wanneer het belangrijkste doel is om dynamische en/of functionele aspecten van synaptische blaasje handel en exocytose te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De behandeling van weefselsecties tijdens specimen voorbereiding voor TEM vereist een aanzienlijke graad van finesse, concentratie en geduld. Bij het gebruik van een micropipet om oplossingen toe te voegen en te verwijderen, kunnen specimens door oppervlaktespanning in de pipet worden gezogen, zodat er grote zorg moet worden besteed aan het vermijden van weefselbeschadiging door de pipet. Ook bepaalde stappen van de uitdroging sequentie kan zo snel als 1 minuut, vandaar de exploitant moet snel werken om ervoor te zorgen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit manuscript werd gesteund door NIH/NIGMS K08 123321 (aan N.L.) en door fondsen van het ministerie van Anesthesiologie bij de Universiteit van Virginia. De auteurs willen bedanken alev Erisir (afdeling biologie, Universiteit van Virginia, Charlottesville, VA) voor een uitstekende opleiding en technische bijstand met TEM, en voor haar waardevolle manuscript kritiek. De auteurs danken ook de geavanceerde elektronenmicroscopie faciliteit bij de Universiteit van Virginia voor technische hulp met specimen en post-bevlekt.
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C., Santini, M. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
- Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
