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Genetics

प्रोस्टेट कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से ट्यूमर organoids की पीढ़ी

Published: June 13, 2019 doi: 10.3791/59710
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology & Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

Summary

हम नेक्रोप्सी और माउस प्रोस्टेट कैंसर मॉडल के विच्छेदन के लिए एक विधि दिखाने के लिए, प्रोस्टेट ट्यूमर विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित. माउस प्रोस्टेट ट्यूमर organoids की पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया है.

Abstract

जीनों को संशोधित करने के लिए समजात पुनर्संयोजन पर आधारित विधियों ने जैविक अनुसंधान को काफी आगे बढ़ाया है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) स्तनधारी विकास और रोग के अध्ययन के लिए एक कठोर तरीका है. हमारी प्रयोगशाला प्रोस्टेट कैंसर के कई GEMMs विकसित किया है (PCa) कि साइट विशेष Cre-loxP recombinase प्रणाली और एक प्रोस्टेट विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग कर एक या कई ट्यूमर suppressor जीन की अभिव्यक्ति की कमी है. इस लेख में, हम इन पीसीए GEMMs के नेक्रोप्सी के लिए हमारी विधि का वर्णन, मुख्य रूप से माउस प्रोस्टेट ट्यूमर के विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित. पिछले दशक में विकसित नए तरीकों ने उपकला व्युत्पन्न कोशिकाओं की संस्कृति को तीन आयामों में इन विट्रो में अंग प्रणालियों को मॉडल करने में सुविधा प्रदान की है। हम भी माउस पीसीए GEMMs से ट्यूमर organoids उत्पन्न करने के लिए एक 3 डी सेल संस्कृति विधि विस्तार. पूर्व नैदानिक कैंसर अनुसंधान 2 डी सेल संस्कृति और सेल लाइन व्युत्पन्न या रोगी व्युत्पन्न xenograft मॉडल का प्रभुत्व रहा है. इन तरीकों ट्यूमर microenvironment, पूर्व नैदानिक अध्ययन में इन तकनीकों का उपयोग करने की एक सीमा की कमी है. GEMMs ट्यूमरजनन और कैंसर की प्रगति को समझने के लिए अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं। ट्यूमर organoid संस्कृति एक इन विट्रो मॉडल प्रणाली है कि ट्यूमर वास्तुकला और सेल वंश विशेषताओं recapitulates है. इसके अलावा, 3 डी सेल संस्कृति तरीकों ट्यूमर सेल संस्कृतियों की तुलना के लिए सामान्य कोशिकाओं के विकास के लिए अनुमति देते हैं, शायद ही कभी संभव 2 डी सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग कर. संयोजन में, पूर्व नैदानिक अध्ययन में GEMMs और 3 डी सेल संस्कृति का उपयोग करने के लिए कैंसर जीव विज्ञान की हमारी समझ में सुधार करने की क्षमता है.

Introduction

1980 के दशक के अंत से, समजात पुनर्संयोजन द्वारा जीनों को बदलने की क्षमता ने जैविक प्रणालियों1के अध्ययन को बहुत उन्नत किया है. प्रेरक, ऊतक-, या सेल-विशिष्ट promotor सिस्टम और साइट-विशिष्ट recombinases, जैसे Cre-loxP, दोनों लौकिक और स्थानिक रूप से आनुवंशिक संशोधनों पर नियंत्रण की सुविधा के द्वारा उन्नत आनुवंशिक अध्ययन किया है2,3, 4. इन आनुवंशिक रणनीतियों के संयोजन ने प्रायोगिक मॉडल प्रणालियों5,6,7की एक विस्तृत सरणी बनाई है .

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) कैसे व्यक्तिगत जीन या जीन के समूहों स्तनधारी विकास और रोग को प्रभावित करने का आकलन करने के लिए एक अभिन्न उपकरण हैं. पूर्व नैदानिक कैंसर अनुसंधान में, GEMMs कैंसर के विकास, प्रगति, और उपचार8का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक और कठोर विधि हैं। हमारी प्रयोगशाला पैदा करने और कैंसर GEMMs की विशेषता में माहिर हैं.

संयुक्त राज्य अमेरिका में पुरुषों के बीच सबसे उच्च निदान गैर-cutaneous कैंसर प्रोस्टेट कैंसर (PCa) है. पीसीए के साथ रोगियों के बहुमत कम जोखिम रोग और जीवित रहने की उच्च संभावना है, लेकिन अस्तित्व की दर काफी गिरावट जब रोग उन्नत चरणों में निदान किया जाता है या यदि लक्षित हार्मोनल चिकित्सा आक्रामक, गैर इलाज पीसीए के लिए प्रगति लाती है उपप्रकार9,10. हमारी प्रयोगशाला GEMMs विकसित किया है कि एक या एक से अधिक ट्यूमर suppressor जीन के floxed alleles का उपयोग. पुनर्संयोजन और ट्यूमर suppressor जीन अभिव्यक्ति की हानि प्रोस्टेट में विशेष रूप से होता है क्योंकि हम केवल प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं में सक्रिय probasin प्रमोटर के क्रे रिकॉमग्नेडाउन बहाव के साथ एक transgene शुरू की है11, 12.हमने अपने जीईएम को एम टी/एमजी नामक क्रे रिपोर्टर ट्रांसजीन को भी शामिल करने के लिए पैदा किया है, जो क्रे13के साथ कोशिकाओं में क्रे और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति की कमी वाली कोशिकाओं में टमाटर फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है । जबकि इस विधि और हमारे प्रतिनिधि परिणाम की प्रस्तुति GEMMs हम अपनी प्रयोगशाला में अध्ययन दिखाने के लिए, इस प्रोटोकॉल किसी भी माउस मॉडल से प्रोस्टेट कैंसर organoids उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, के रूप में हमारे प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तार से चर्चा की, हमने देखा है कि कुछ ट्यूमर विशेषताओं प्रोस्टेट कैंसर organoid पीढ़ी के लिए इष्टतम हैं.

पिछले दशक में , उपकला मूल के ऊतकों से कोशिकाओं को संचित करने के नए तरीकों से इन विट्रो14,15में अंग प्रणालियों को मॉडल करने की हमारी क्षमता में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है . शब्द "3 डी सेल संस्कृति" organoids की स्थापना और बनाए रखने में शामिल तकनीकों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है, जो आम तौर पर कोशिकाओं से बना संरचनाओं के रूप में परिभाषित किया जा सकता है कि अंग-विशिष्ट कोशिका वंश द्वारा संचालित माध्यमिक वास्तुकला इकट्ठा विशेषताओं16| इन नए तरीकों में क्लासिक 2 D सेल संस्कृति से अलग हैं कि कोशिकाओं को दीर्घकालिक विकास के लिए परिवर्तन या अमरीकरण की आवश्यकता नहीं है; इस प्रकार, सामान्य कोशिकाओं के 3 डी संस्कृतियों रोगग्रस्त कोशिकाओं की तुलना में किया जा सकता है. यह कैंसर अनुसंधान में विशेष रूप से मूल्यवान है जहां सामान्य सेल नियंत्रण संस्कृतियों आम तौर पर उपलब्ध नहीं किया गया है. इसके अलावा, organoids स्वतः उचित रूप से विभेदित सेल प्रकार के साथ माध्यमिक ऊतक आर्किटेक्चर फार्म, उन्हें एक बेहतर मॉडल प्रणाली बनाने के लिए 2 डी सेल लाइनों17से इन विट्रो में कैंसर को समझने के लिए. हमारी प्रयोगशाला ट्यूमर मुद्दे से 3 डी organoid लाइनों बनाया गया है हमारे PCA GEMMs से अलग करने के लिए हमारे vivo डेटा में पूरक और प्रयोगों जो GEMMs में संभव नहीं होगा प्रदर्शन.

इस आलेख में, हम विशिष्ट माउस प्रोस्टेट लोब और मेटास्टैटिक घावों के विच्छेदन सहित, पीसीए GEMMs की पूरी नेक्रोप्सी के लिए लिखित और दृश्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम वर्णन और माउस प्रोस्टेट ट्यूमर से organoids पैदा करने के लिए एक कदम दर कदम विधि दिखाने के एक प्रोटोकॉल के आधार पर पहले Drost एट अल द्वारा प्रकाशित सामान्य माउस प्रोस्टेट उपकला ऊतक से organoids प्राप्त करने के लिए18.

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Protocol

यहाँ वर्णित पशु प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु संसाधन विभाग में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया, Roswell पार्क व्यापक कैंसर केंद्र, भैंस, न्यूयॉर्क.

नोट: नर चूहों organoids की पीढ़ी के लिए प्रोस्टेट या प्रोस्टेट ट्यूमर को अलग करने के लिए विच्छेदन किया जाना चाहिए कम से कम यौन परिपक्वता की उम्र तक पहुँच जाना चाहिए - उम्र के बारे में 8-10 सप्ताह. चूहों की विशिष्ट उम्र के अध्ययन के बीच भिन्न हो सकते हैं. कुछ कारकों पर विचार करने के लिए जब उम्र का चयन प्रोस्टेट सेल आबादी में उम्र पर निर्भर परिवर्तन, विशिष्ट प्रमोटर संचालित क्रे transgenes की उम्र पर निर्भर अभिव्यक्ति, और एक विशेष GEMM में प्रोस्टेट ट्यूमर प्रगति की दर शामिल हैं.

1. विच्छेदन और माउस ProstateTumor और Metastatic ट्यूमर की इमेजिंग

  1. तैयारी
    1. आवश्यक बाँझ विच्छेदन उपकरण प्राप्त करें। एक 15 सेमी शासक, सटीक संतुलन, विश्लेषणात्मक संतुलन, 70% इथेनॉल, फॉस्फो-बफर नमकीन (पीबीएस), और कागज तौलिए के साथ स्वच्छ बाँझ सतह पर स्टेज विच्छेदन क्षेत्र।
    2. आंत अंगों और हड्डियों के लिए स्थिर समाधान की तैयारी organoid पीढ़ी के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा करने के लिए
      1. अंतरंग अंगों के लिए: पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) तैयार करें। एक माउस के लिए, 20 एमएल 4% पीएफए, दो 15 एमएल शंकु ट्यूबों में alicot बनाने के लिए और उपयोग जब तक कमरे के तापमान पर रहते हैं।
      2. लंबी हड्डियों के लिए: अलीकोट 10 एमएल पूर्व बनाया 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन (NBF) एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में और उपयोग जब तक कमरे के तापमान पर रहते हैं।
    3. अनुपचारित 10 सेमी व्यंजन प्राप्त करें और गैर बाँझ पीबीएस के साथ भरें - ये विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ठीक विच्छेदन के दौरान अंगों के लिए अस्थायी कंटेनर के रूप में काम करेंगे।
      नोट: बाँझ उपकरण organoids पैदा करने के लिए ऊतकों को विभाजित करने के लिए उपयोग किया जाता है। गैर बाँझ उपकरण पिछले अंगों के प्रारंभिक चीरा और विच्छेदन के लिए उपयोग किया जाता है।
  2. इच्छामृत्यु और प्रारंभिक चीरा
    1. 5 मिनट के लिए 2.0 L/min प्रवाह दर का उपयोग करके CO2 asphyxiation द्वारा माउस को यूथेनाइज करें. माउस को पिंजरे से निकालें और ग्रीवा विस्थापन करें. माउस के शरीर के वजन और रिकॉर्ड को मापने के लिए सटीक संतुलन का उपयोग करें।
    2. एक कागज तौलिया के शीर्ष पर माउस प्लेस और विच्छेदन सतह अधर पक्ष पर उन्मुख माउस के सिर अन्वेषक से दूर का सामना करना पड़ के साथ. अपने अंगों को बाहर खींच और एक डिस्पोजेबल सुई के साथ forepaws और पिछले पंजे के प्रत्येक भेदी द्वारा बोर्ड के लिए माउस को प्रत्यय।
    3. एक स्प्रे बोतल का उपयोग करना, 70% इथेनॉल के साथ माउस के फर douse. गैर बाँझ विच्छेदन कैंची और सीधे संदंश का उपयोग करना, बस माउस के लिंग के ऊपर चुटकी और फर के माध्यम से ही एक छोटा सा चीरा बनाते हैं.
    4. चीरा केवल फर के माध्यम से माउस की गर्दन तक midline जारी रखें. केवल फर के माध्यम से माउस के अधर विमान के माध्यम से प्रारंभिक चीरा के बिंदु से द्विपक्षीय चीरा बनाओ.
    5. फर को पकड़ें और ध्यान से इसे माउस की त्वचा से दूर खींच लें। दोनों पेट और वक्ष गुहाओं के लिए उपयोग की अनुमति देने के लिए बोर्ड के लिए फर नीचे पिन.
  3. पुरुष यूरोजेनिक प्रणाली एन ब्लॉक का निष्कर्षण
    1. बाँझ विच्छेदन कैंची और सीधे संदंश का उपयोग करना, ध्यान से मलाशय के ऊपर 0.75 सेमी के बारे में त्वचा के माध्यम से कटौती. पेट की गुहा में किसी भी अंग को परेशान किए बिना रिबकेज तक चीरा मिडलाइन जारी रखें। ध्यान से त्वचा दूर खींच और बोर्ड के लिए पिन पूरे पेट गुहा का पर्दाफाश करने के लिए.
      नोट: इन उपकरणों को माउस के बाहर या मचान क्षेत्र में किसी भी सतह को छूने की अनुमति न दें, क्योंकि इन ऊतकों का उपयोग organoids उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा।
    2. चित्र 1कमें चित्र के अनुसार यूरोजेनिक प्रणाली और अन्य अंगों को अलग करें, जिसमें संख्याएं दर्शाती हैं कि अंग माउस से हटा दिए जाएँगे।
    3. मूत्राशय का पता लगाएं, तो या तो छोड़ दिया है या सही करने के लिए वसा पैड समझ और अंडकोष का पर्दाफाश करने के लिए ऊपर की ओर खींच. ध्यान से यूरोजेनिकल क्षेत्र के बाकी हिस्सों से अंडकोष को दूर कर के अलावा रख दिया। दूसरी तरफ एक ही प्रक्रिया करो.
      नोट: प्रोस्टेट ट्यूमर के इष्टतम ऊतक की गुणवत्ता और विस्तृत ट्यूमर लक्षण प्राप्त करने की आवश्यकता है कि पूरे यूरोजेनिक क्षेत्र माउस एन ब्लॉक19से हटा दिया जाना चाहिए . यह अनुशंसा की जाती है कि यूरोजेनेटी क्षेत्र को पहले हटा दिया जाए (चित्र 1क)
    4. मूत्राशय को पतला करें और ध्यान से ऊपर खींचें ताकि यूरोजेनिकल क्षेत्र एक साथ उठाता है, नीचे मूत्रमार्ग को उजागर करता है। मूत्राशय को पकड़े हुए, कैंची को उन्मुख करें ताकि वे पृष्ठीय प्रोस्टेट के नीचे के खिलाफ हैं और मूत्रमार्ग में कटौती करें। पूरे मूत्रजननांगी क्षेत्र तो पेट की गुहा से जारी होगा.
    5. पीबीएस से भरे 10 सेमी पकवान में यूरोजेनिक क्षेत्र को रखो। यदि अभी भी मूत्र से भरा हुआ है, तो एक छोटा सा चीरा बनाकर मूत्राशय को छान लें। विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करना, यूरोजेनिक प्रणाली और रिकॉर्ड वजन.
  4. श्रोणि लिम्फ नोड्स, तिल्ली, जिगर, गुर्दे, फेफड़ों, टिबिया, और फीमर का निष्कर्षण
    1. यूरोजेनिक प्रणाली को हटाने से श्रोणि लिम्फ नोड्स को उजागर किया जाता है, जो यूरोजेनिक प्रणाली के ठीक पीछे स्थित होता है (चित्र 1ए) और रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर। लिम्फ नोड्स केवल तभी दिखाई देगा जब उनमें मेटास्टैटिक घाव होते हैं या यदि स्थानीय सूजन होती है। लिम्फ नोड के नीचे सीधे बलप्स को ओरिएंट करें और लिम्फ नोड को हटाने के लिए ऊपर खींचें। दूसरी तरफ एक ही प्रक्रिया करो.
    2. सीधे संदंश और कट के साथ मलाशय grasp. मलाशय पर खींच पूरे बृहदान्त्र और छोटी आंत को जानने के लिए, mesenteric लिम्फ नोड्स में metastatic घावों की तलाश में. जब पूरे ileum हटा दिया जाता है, पेट को बेनकाब करने के लिए ग्रहणी पर खींचने के लिए जारी है. पेट को पूरी तरह से हटाने और छोड़ने के लिए घेघा काटें। यदि लिम्फ नोड्स में किसी भी मेटास्टैटिक घावों को देखा जाता है, तो ध्यान से आंत से दूर विच्छेदन करें और पीबीएस के 10 सेमी डिश में स्टोर करें।
    3. पेट को उजागर करना और हटाने से तिल्ली पेट के पृष्ठीय पक्ष से खींच ली जाएगी (चित्र 1क) तिल्ली निकालें और 4% पीएफए में जगह. तिल्ली हेमोटॉक्सिलिन के लिए एक धुंधला नियंत्रण के रूप में कार्य करता है क्योंकि यह अत्यधिक सेलुलर है।
      नोट: विसरल ऊतकों को ऑर्गनॉइड उत्पादन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाएगा, 4% पीएफए में रात भर तय किया जाएगा, पीबीएस के साथ धोया जाएगा, और फिर 70 % इथेनॉल में रखा जाएगा।
    4. पेट के ऊपरी भाग में जिगर निकालें (चित्र 1ए) जिगर में metastatic लोड के आधार पर, व्यक्तिगत lobes विच्छेदन किया जा सकता है, या पूरे जिगर ध्यान से डायाफ्राम के साथ काटने से हटाया जा सकता है. (इस समय डायाफ्राम के माध्यम से कटौती न करें)। पीबीएस के 10 सेमी पकवान में जिगर रखें।
    5. जिगर को हटाने से रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर गुर्दे पूरी तरह से बेनकाब हो जाएंगे (चित्र 1ए) . गुर्दे निकालें - गुर्दे लिम्फ नोड्स के साथ, अगर नोड्स metastatic घावों है - गुर्दे के नीचे सीधे forceps रखकर और ऊपर खींच. दूसरे पक्ष के लिए एक ही प्रक्रिया करो.
    6. वक्ष गुहा को बेनकाब करने के लिए, ध्यान से रिबकेज के साथ डायाफ्राम को काट लें। डायाफ्राम भेदी वक्ष गुहा में नकारात्मक दबाव जारी है और दिल और फेफड़ों को बेनकाब करेगा (चित्र 1ए) .
    7. स्टर्नम को पकड़ें और वक्ष गुहा को आगे खोलने के लिए ऊपर खींचें। वक्ष लिम्फ नोड्स में मेटास्टैटिक घावों के लिए रिब पिंजरे के साथ वक्ष गुहा के अधर चेहरे का निरीक्षण करें और यदि मौजूद हो तो विच्छेदन करें।
    8. अभी भी स्टर्नम पकड़े हुए, दिल और फेफड़ों का उपयोग करने के लिए अधर रिब पिंजरे को काट दिया। दिल को पकड़, ऊपर खींच और फेफड़ों के नीचे कटौती. दिल और फेफड़ों को पूरी तरह से हटाने के लिए, सभी पूर्वकाल रक्त वाहिकाओं और श्वासनली में कटौती। पीबीएस में ऊतक प्लेस और ध्यान से फेफड़ों के ऊतकों या फेफड़ों metastatic घावों को नुकसान पहुँचाए बिना दिल को हटा दें।
    9. गैर बाँझ सीधे बलप्स ले लो और कैंची विच्छेदन और femur के सिर पर पिछले पैर में कटौती. फीमर को ध्यान से समझें और फर से पिछले पैर को हटा दें।
    10. एक कागज तौलिया पर पिछले पैर प्लेस और पिछले पंजा समझ. टिबिया और फीमर से सभी मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को स्क्रैप करने के लिए एकल किनारे रेजर ब्लेड का उपयोग करें। पेटलावद के पीछे काटने से टिबिया से फीमर निकालें और पिछले पंजा को हटा कर टिबिया को हटा दें। 10% एनबीएफ में टिबिया और फीमर रखें। दूसरी तरफ एक ही प्रक्रिया करो.
      नोट: मेटास्टैटिक घावों के लिए माउस की लंबी हड्डियों की जांच करने के प्रयोजनों के लिए, फिबुला को बरकरार रखने की आवश्यकता नहीं है। लंबी हड्डियों को एक सप्ताह के लिए 10% एनबीएफ में ठीक किया जाएगा, फिर तटस्थ EDTA समाधान20का उपयोग करके decalcified . तीन सप्ताह के बाद, हड्डियों 70% इथेनॉल के लिए स्थानांतरित किया जाएगा.
    11. पिछले अंगों को हटाने के बाद, भविष्य जीनोटाइपिंग के लिए एक कान या पूंछ काटने ले। माउस के शव और सभी ऊतक को छोड़ दें जो ऑर्गेनोइड पीढ़ी के लिए ठीक न हो या उपयोग न करें।
  5. प्रोस्टेट ट्यूमर का विच्छेदन
    नोट: माउस प्रोस्टेट लोब ों का विच्छेदन केवल विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी19का उपयोग करके ही प्राप्त किया जा सकता है . हालांकि, प्रोस्टेट ट्यूमर लोड इतना अधिक हो सकता है कि व्यक्तिगत lobes प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, और विच्छेदन एक माइक्रोस्कोप के बिना किया जा सकता है। फिर भी, व्यक्तिगत प्रोस्टेट lobes के विच्छेदन के लिए पूर्ण प्रोटोकॉल नीचे वर्णित है.
    1. यूरोजेनिकल क्षेत्र को पीबीएस के 10 सेमी डिश में एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत रखें और अन्वेषक से दूर मूत्राशय और मौलिक vesicles के साथ अधर पक्ष को उन्मुख करें। यूरोजेनिक क्षेत्र के सभी हेरफेर बाँझ उपकरणों का उपयोग किया जाना चाहिए।
    2. प्रोस्टेट ट्यूमर के सामान्य फीनोटाइप का आकलन करें- सबसे अधिक संभावना, या तो एक तरल पदार्थ से भरे या ठोस ट्यूमर को पीसीए जीईएमएस में देखा जाएगा (चित्र 2ए, बी)।
      नोट: द्रव से भरे ट्यूमर अक्सर पूर्ववर्ती प्रोस्टेट क्षेत्र में स्थित होते हैं (चित्र 2क)। द्रव भरा ट्यूमर अल्प उपकला घटकों के साथ मुख्य रूप से संयोजी ऊतक से बना रहे हैं - इस प्रकार इन ट्यूमर क्योंकि ट्यूमर उपकला कोशिकाओं की कम संख्या के organoid पीढ़ी के लिए इष्टतम नहीं हैं, के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा की जाएगी अनुभाग.
    3. यदि तरल पदार्थ भरा ट्यूमर मौजूद हैं, ट्यूमर में एक छोटा सा छेद प्रहार. पीबीएस के एक नए 10 सेमी पकवान में यूरोजेनिक क्षेत्र रखें।
    4. प्रभावी हाथ में गैर-प्रमुख हाथ और घुमावदार बलप्स में सीधे संदंश की एक जोड़ी ली जाए। यूरोजेनिक क्षेत्र को उसके पृष्ठीय चेहरे पर पलटें। समीपस्थ प्रोस्टेट क्षेत्र (चित्र1बी) की खोज की जाए, जिसे मूत्रमार्ग के गुलाबी/लाल रंग से पहचाना जा सकता है। मूत्रमार्ग grasp और मजबूती से पकड़ तो घुमावदार forceps के साथ यूरोजेनिक ऊतक हेरफेर करने के लिए.
      नोट: प्रोस्टेट विच्छेदन के दौरान, हमेशा मूत्राशय के स्थान पर ध्यान दें, क्योंकि यह व्यक्तिगत प्रोस्टेट लोब का पता लगाने का सबसे आसान तरीका है (चित्र 1ख)।
  6. यूरोजेनिक क्षेत्र से गैर-प्रोस्टेट ऊतक को हटाना
    1. जबकि अभी भी यूरोजेनिकल क्षेत्र के पृष्ठीय चेहरे पर, मौलिक vesicle का आधार पाते हैं. ध्यान से मौलिक vesicle निकालें और छोड़ें. विपरीत पक्ष पर एक ही प्रक्रिया प्रदर्शन.
      नोट: मौलिक आशय को puncturing से बचें, क्योंकि यह चिपचिपा और अपारदर्शी स्रावी तरल पदार्थ जारी करेगा जो प्रोस्टेट विच्छेदन के साथ हस्तक्षेप करता है। यदि मौलिक vesicle पंचर है, ताजा पीबीएस के साथ नए 10 सेमी पकवान के लिए शेष यूरोजेनिकल क्षेत्र हस्तांतरण.
    2. निकालें और वीएएस deferens और के रूप में ज्यादा फैटी और संयोजी ऊतक के रूप में संभव के रूप में बल के घुमावदार पक्ष का उपयोग छोड़ दें.
    3. हालांकि अभी भी मजबूती से मूत्रमार्ग / समीपस्थ प्रोस्टेट क्षेत्र पकड़े हुए, मूत्रमार्ग से मूत्राशय को हटाने के लिए ठीक, नुकीली कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  7. व्यक्तिगत प्रोस्टेट खण्डों का अलगाव
    1. पूर्ववर्ती प्रोस्टेट का पता लगाएँ (चित्र 1ठ)। सीधे संदंश के साथ समीपस्थ प्रोस्टेट क्षेत्र/यूरेथ्रा को मजबूती से पकड़ना सुनिश्चित करें। सीधे forceps के घुमावदार पक्ष के साथ ऊतक समझ और मजबूती से यह मूत्राशय और प्रोस्टेट के बाकी से दूर खींच द्वारा पूर्वकाल प्रोस्टेट क्षेत्र निकालें. पीबीएस में ऊतक रखें।
      नोट: सभी प्रोस्टेट क्षेत्रों के लिए, ट्यूमर के आकार के आधार पर, ऊतक को हटाने के लिए कैंची विच्छेदन की आवश्यकता हो सकती है।
    2. अधर प्रोस्टेट क्षेत्र की स्थिति जानें (चित्र1ठ) चरण 1.5.7 के समान ही अधर प्रोस्टेट क्षेत्र निकालें.
    3. विच्छेदन में इस बिंदु पर, केवल पार्श्व और पृष्ठीय प्रोस्टेट क्षेत्रों मौजूद होना चाहिए, जबकि समीपस्थ प्रोस्टेट क्षेत्र अभी भी सीधे संदंश द्वारा समझा जा रहा है. पार्श्व ीय तथा पृष्ठीय प्रोस्टेट क्षेत्रों का आकलन करें (चित्र 1ठ)। यदि पार्श्व क्षेत्र पृष्ठीय क्षेत्र से अलग किया जा सकता है, तो चरण 1.5.7 में वर्णित के रूप में पार्श्व प्रोस्टेट क्षेत्र को हटा दें। विपरीत दिशा में एक ही प्रक्रिया करो.
    4. पृष्ठीय प्रोस्टेट क्षेत्र निकालें के रूप में चरण 1.5.7 में वर्णित है. 4% पीएफए में समीपस्थ प्रोस्टेट क्षेत्र रखें, क्योंकि मूत्रमार्ग के पेशी ऊतक के भीतर इसकी संरचना इसे ऑर्गनॉइड पीढ़ी के लिए अनुपयुक्त बनाती है।

2. प्रोस्टेट ट्यूमर ऊतक से 3 डी organoids की पीढ़ी

नोट: चित्र 3 ट्यूमर organoids के उत्पादन के लिए प्रक्रिया का एक सचित्र वर्णन से पता चलता है.

  1. तैयारी
    1. निम्नलिखित परिवर्तन के साथ Drost एट अल 18 के अनुसार माउस प्रोस्टेट organoid मीडिया तैयार करें। नोगिन और आर-स्पॉन्डिन के लिए रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के बजाय वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करें और 1% (v/v) की अंतिम एकाग्रता का उपयोग करें, 10% के बजाय, नोगिन- और आर-स्पॉन्डिन-कंडीशन्ड माध्यम दोनों के लिए।
      नोट: HEK293 कोशिकाओं stably हा-माउस नोगिन-एफसी या हा-माउस Rspo1-एफसी के साथ stably transfected नोगिन- या आर-स्पोन्डिन वातानुकूलित माध्यम, क्रमशः उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन सेल लाइनों स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में केल्विन कू प्रयोगशाला से एक उपहार थे.
    2. उन्नत DMEM/F12(++) मीडिया के साथ उन्नत DMEM/F12(++) मीडिया के साथ 20 मिलीग्राम/एमएल कोलैजाज़ II को 5 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए 15 एमएल ट्यूब में पाचन समाधान तैयार करें। 10 डिग्री एम के अंतिम एकाग्रता में कोलैडेस द्वितीय समाधान के लिए Y-27632 रॉक अवरोधक जोड़ें।
      नोट: ऊतक के लिए पाचन बफर का अनुपात 1 एमएल से 50 मिलीग्राम है, जिसे हम Drost et al.18के अनुसार उपयोग करते हैं।
  2. ट्यूमर ऊतक के खनन और पाचन
    1. सेल संस्कृति हुड में, एक बाँझ 10 सेमी संस्कृति पकवान में प्रोस्टेट ट्यूमर ऊतक जगह, विच्छेदन और नेक्रोटिक ऊतक त्यागें।
    2. शेष प्रोस्टेट ट्यूमर ऊतक में मिन्स 1 मिमी3 क्यूब्स बाँझ घुमावदार संदंश के साथ ऊतक टुकड़े पकड़े और विच्छेदन कैंची के साथ काटने से।
    3. उन्हें forceps के घुमावदार पक्ष के साथ scooping द्वारा पाचन बफर के साथ 15 एमएल ट्यूब में कीमा बनाया ट्यूमर टुकड़े प्लेस. 1.5 से 2 ज के लिए मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूमर ऊतक डाइजेस्ट पाचन प्रगति हर 20 मिनट की जाँच करें।
      नोट: इस समय, -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण और बर्फ पर thaw से मैट्रिक्स के कम से कम 2 एमएल बाहर ले लो. मैट्रिक्स के 1 एमएल alicots लगभग 3 एच thaw करने के लिए ले जाएगा.
    4. ऊतक पाचन के बाद, एक सेल गोली बनाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 175 x g पर अपकेंद्रित्र ट्यूब।
    5. supernatant निकालें, सेल गोली ढीला करने के लिए ट्यूब झटका, और 1 एमएल में सेल गोली resuspend पूर्व-वार्म्ड trypsin के साथ पूरक 10 $M Y-27632 रॉक अवरोधक. 5 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब रखो.
    6. ऊष्मायन के बाद, एक मानक P1000 टिप के साथ 5 बार ऊपर और नीचे पिपेट। एक और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान करने के लिए ट्यूब पर लौटें और चरण 2.2.6 दोहराएँ।
      नोट: प्रक्रिया में इस समय, एक बाँझ 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति पकवान गर्म यह एक 55 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में डाल द्वारा.
  3. गिनती कोशिकाओं और मैट्रिक्स में resuspension
    1. 9 एमएल ठंड AdDMEM/F12(+++) जोड़कर कोशिकाओं को धो लें और ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 175 x g पर अपकेंद्रण करें।
    2. अपकेंद्रण के बाद, supernatant निकालें, गोली ढीला करने के लिए ट्यूब झटका, और ठंड AdDMEM/F12 (++++) के 10 एमएल जोड़कर फिर से कोशिकाओं को धोने. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 175 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. centrifugation के बाद, supernatant को हटा दें, गोली ढीला करने के लिए ट्यूब झटका, AdDMEM/F12 के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (+++), और मानक प्रक्रिया के अनुसार एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की संख्या गिनती.
    4. सात से आठ गुंबदों एक 6 अच्छी तरह से पकवान के एक कुएं में फिट जब organoids एक बूंद के लिहाज से फैशन के माध्यम से मैट्रिक्स में चढ़ाया जाता है. मैट्रिक्स के लगभग 200 $L 7-8 गुंबदों का उत्पादन होगा. तय करें कि भविष्य के प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए organoids के कितने कुओं की जरूरत है और आवश्यक मैट्रिक्स की मात्रा की गणना. फिर, मैट्रिक्स के 1ण्0 x 106 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए आवश्यक सेल युक्त विलयन की मात्रा की गणना कीजिए।
    5. कोशिकाओं की गिनती के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 175 x g पर अपकेंद्रित्र। supernatant निकालें, गोली ढीला करने के लिए ट्यूब झटका, और चरण 2.3.4 में गणना मैट्रिक्स की मात्रा में कोशिकाओं resuspend.
      नोट: मैट्रिक्स केवल 4 डिग्री सेल्सियस पर तरल रूप में रहता है; मैट्रिक्स स्टॉक ट्यूब और मैट्रिक्स सेल समाधान बर्फ पर हर समय रहते हैं.
  4. चढ़ाना मैट्रिक्स गुंबदों और मीडिया के आवेदन
    1. समान रूप से बुलबुले शुरू करने के बिना कोशिकाओं को वितरित करने के लिए एक P200 पाइप के साथ मैट्रिक्स सेल समाधान मिक्स. 55 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से 6-वेल कल्चर डिश निकालें।
    2. ध्यान से मैट्रिक्स सेल समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस pipette और जल्दी से गुंबदों बनाने के लिए एक अच्छी तरह से में समाधान ड्रॉप.
    3. चरण 2.4.2 दोहराएँ. मैट्रिक्स सेल समाधान की मात्रा खर्च किया जाता है जब तक. गुंबदों को 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठोस करने की अनुमति दें।
    4. 6-वेल डिश को ऊपर-नीचे पलटें और डिश को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में डाल दें ताकि 20 मिनट के लिए ठोसीकरण जारी रखा जा सकता है।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से माउस प्रोस्टेट organoid मीडिया के 2 एमएल जोड़ें. सिंथेटिक एण्ड्रोजन R1881 1 एनएम और Y-27632 रॉक अवरोधक की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक अंतिम एकाग्रता के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए जोड़ें 10 डिग्री एम. सावधानी से मिलाएं और प्लेट को culturing के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: Organoid संस्कृति मीडिया के साथ पूरक की जरूरत है 10 $M Y-27632 रॉक अवरोधक केवल 1 सप्ताह organoid पीढ़ी के बाद के लिए.

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Representative Results

पूर्वकाल प्रोस्टेट क्षेत्र में एक बड़े तरल पदार्थ से भरे प्राथमिक प्रोस्टेट ट्यूमर के साथ एक माउस के प्रतिनिधि नेक्रोप्सी छवियों चित्र 2एमें दिखाए गए हैं। इसके विपरीत, चित्र ााला 2ठ,एक बड़े ठोस प्राथमिक प्रोस्टेट ट्यूमर के साथ माउस की प्रतिक नेक्रोप्सी छवियों को दिखाता है जिसके लिए अलग-अलग प्रोस्टेट क्षेत्र निर्विवाद होते हैं. फ्लोरोसेंट विच्छेदन छवियों चित्र 2बी GFP व्यक्त से एक ही ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर दिखाने के लिए, यह दर्शाता है कि ट्यूमर कोशिकाओं क्रे व्यक्त (चित्र 2ब्) . ऊतक जो प्रोबेसिन को व्यक्त नहीं करता है, जैसे कि मूत्राशय, टमाटर को व्यक्त करता है और इस प्रकार क्रे व्यक्त नहीं करता है (चित्र 2ब्)। चित्रा 2बी से माउस से जिगर और फेफड़ों में जीएफपी को व्यक्त करने वाले मेटास्टैटिक ट्यूमर हैं, जो यह दर्शाते हैं कि वे प्राथमिक प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न हुए हैं, और सामान्य ऊतक से घिरे हुए हैं जो टमाटर को व्यक्त करता है (चित्र 2ब् ). अंत में, इस माउस से श्रोणि लिम्फ नोड GFP और नहीं टमाटर व्यक्त करता है, यह दर्शाता है कि इस metastatic ट्यूमर इस अंग से आगे निकल गया है और कोई सामान्य ऊतक रहता है (चित्र 2सी).

हम organoids हम एक ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न किया है की चित्रा 4 में छवियों को दिखाने के. 1 दिन में, छोटे organoids बना रहे हैं, के रूप में प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों में देखा. 1 दिन पर फ्लोरोसेंट छवियों से पता चलता है कि दोनों टमाटर और GFP व्यक्त कोशिकाओं ट्यूमर organoid संस्कृति (तीर) में मौजूद हैं. हालांकि, 7 दिन तक जब प्रोस्टेट ट्यूमर organoids पूरी तरह से गठन किया है, इन organoids GFP व्यक्त कर रहे हैं और नहीं टमाटर. इन आंकड़ों का सुझाव है कि इन organoids ट्यूमर कोशिकाओं है कि Cre व्यक्त कर रहे थे और सामान्य उपकला कोशिकाओं से नहीं से उत्पन्न हुआ है. इन ट्यूमर organoids केवल GFP सकारात्मक होने के रूप में हम पारित करने के लिए हमारी संस्कृति का विस्तार जारी 1 और 2.

चित्रा 5में, हम organoids हम एक तरल पदार्थ से भरे प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न किया है की छवियों को दिखाने के. पहले दिन, छोटे organoids के गठन कर रहे हैं, और फ्लोरोसेंट छवियों से पता चलता है कि दोनों टमाटर- और GFP-expressing कोशिकाओं organoid संस्कृति में मौजूद हैं - एक ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न organoids के लिए दिन 1 में हमारे अवलोकन के समान (चित्र 4). हालांकि, एक तरल पदार्थ से भरे प्रोस्टेट ट्यूमर से organoids या तो GFP या टमाटर 7 दिन में एक्सप्रेस - संकेत मिलता है कि organoids कोशिकाओं है कि क्रे व्यक्त नहीं से गठन किया है. यह पैटर्न मार्ग 1 और मार्ग 2 पर जारी है, जहां संस्कृति दोनों टमाटर है- और GFP-expressing organoids. इन organoids के आगे विश्लेषण गंभीर रूप से सीमित है क्योंकि लाइन सामान्य उपकला organoids और ट्यूमर organoids का एक मिश्रण है. हम मानते हैं कि तरल पदार्थ से भरे प्रोस्टेट ट्यूमर ट्यूमर organoids पैदा करने में suboptimal हैं सिर्फ इसलिए कि वहाँ सामान्य प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत है. चूंकि दोनों सामान्य प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं और प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं organoids फार्म, तरल पदार्थ से भरा प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न लाइनों सामान्य और कैंसर organoids का एक मिश्रण कर रहे हैं. हम GFP-सकारात्मक कोशिकाओं के लिए प्रवाह छँटाई और कोशिकाओं की आबादी से organoids पैदा करने से तरल पदार्थ से भरे प्रोस्टेट ट्यूमर से शुद्ध ट्यूमर organoid लाइनों प्राप्त करते हैं। ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर मुख्य रूप से ट्यूमर कोशिकाओं के शामिल हैं, इसलिए इन ट्यूमर से उत्पन्न organoids GFP के लिए पूर्व छँटाई के बिना कैंसर organoids के एक अधिक शुद्ध आबादी हैं.

Figure 1
चित्र 1 : प्रोस्टेट कैंसर के लिए हमारी सिफारिश विच्छेदन आदेश (PCa) आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) और माउस प्रोस्टेट के शरीर रचना विज्ञान. (ए) आदेश हम एक पीसीए GEMM से प्रमुख अंगों को अलग करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल में सिफारिश करते हैं। 1. यूरोजेनेज क्षेत्र। 2. श्रोणि लिम्फ नोड्स. 3. तिल्ली. 4. जिगर. 5. गुर्दे. 6. फेफड़े. 7. टिबिया और फेमर। (बी) माउस यूरोजेनेटील क्षेत्र और प्रोस्टेट शरीर रचना विज्ञान का मानचित्र। एक 12 सप्ताह पुराने माउस की फ्लोरोसेंट विच्छेदन छवियों probasin-Cre और mT/mG क्रे रिपोर्टर transgene व्यक्त. मूत्राशय (बीएल), मौलिक vesicles (एसवी), पूर्वकाल प्रोस्टेट (एपी), अधर प्रोस्टेट (वीपी), पार्श्व प्रोस्टेट (एलपी), पृष्ठीय प्रोस्टेट (डीपी), और आसन्न प्रोस्टेट (पीपी).। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : प्रोस्टेट कैंसर (PCa) आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) के प्रतिनिधि विच्छेदन छवियों. (ए) मूत्र गुहा मूत्र जननी क्षेत्र और एक तरल पदार्थ से भरे प्रोस्टेट ट्यूमर के साथ यूरोजेनिक क्षेत्र को हटाने से पहले। (बी) यूरोजेनिक क्षेत्र और एक ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर के साथ यूरोजेनिक क्षेत्र को हटाने से पहले पेट की गुहा। (सी) प्रतिनिधि टमाटर और GFP एक ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर के फ्लोरोसेंट छवियों, जिगर, फेफड़े, और एक पीसीए GEMM कि metastatic घावों विकसित से श्रोणि लिम्फ नोड. स्केल बार - 5 मिमी मूत्राशय (बीएल), पूर्वकाल प्रोस्टेट (एपी), और पृष्ठीय प्रोस्टेट (डीपी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : प्रोस्टेट ट्यूमर organoids पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल का प्रवाह चार्ट. प्रोस्टेट ट्यूमर विच्छेदन के बाद, 1 मिमी टुकड़े में ऊतक कीमा। कोलैडेनेस में ट्यूमर के टुकड़े को डाइजेस्ट करें, कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ट्रिप्सिन में पचाएं। कोशिकाओं की गिनती के बाद, एक 1.0 x 106 सेल सेल एकाग्रता के लिए आवश्यक मैट्रिक्स की मात्रा में resuspend. एक बूंद वार विधि का उपयोग कर डिश में प्लेट गुंबदों. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : एक ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर से माउस प्रोस्टेट ट्यूमर organoids की पीढ़ी से प्रतिनिधि छवियों. प्रतिनिधि चरण इसके विपरीत, टमाटर, और GFP फ्लोरोसेंट छवियों से दिन 1, दिन 7, मार्ग 1, और एक ठोस माउस प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न organoids के मार्ग 2. स्केल बार - 100 डिग्री मी. तीर फ्लोरोसेंट छवियों में अलग-अलग कोशिकाओं को इंगित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : एक तरल पदार्थ से भरे ट्यूमर से माउस प्रोस्टेट ट्यूमर organoids की पीढ़ी से प्रतिनिधि छवियों. प्रतिनिधि चरण इसके विपरीत, टमाटर, और GFP फ्लोरोसेंट छवियों से दिन 1, दिन 7, मार्ग 1, और एक तरल पदार्थ से भरे माउस प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न organoids के मार्ग 2. स्केल बार - 100 डिग्री मी. तीर फ्लोरोसेंट छवियों में अलग-अलग कोशिकाओं को इंगित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोस्टेट ट्यूमर विच्छेदन और organoid पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
गैर-प्रोस्टेट ऊतक को हटाना और माउस प्रोस्टेट ट्यूमर के ठीक विच्छेदन कैंसर organoids के इष्टतम पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि दोनों गैर-प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं और सामान्य प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं organoids उत्पन्न होगा. ठोस प्रोस्टेट ट्यूमर के लिए विशेष रूप से, यह व्यवहार्य ट्यूमर के क्षेत्रों को अलग करने के लिए नेक्रोटिक ऊतक है कि व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या कम हो जाएगा के साथ संदूषण को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. organoid पीढ़ी के दौरान, collagenase के साथ ऊतक पाचन लगन से निगरानी की जानी चाहिए, कोलैजाकेस के लिए लंबे समय तक जोखिम सेल व्यवहार्यता को सीमित करेगा के रूप में. कैंसर GEMMs से प्राप्त organoids के साथ, यह पूरी तरह से genotype प्रत्येक पंक्ति के लिए महत्वपूर्ण है सुनिश्चित करें कि सभी transgenes और संशोधित alleles कि माउस में इंजीनियर थे organoids में मौजूद हैं. लंबे समय तक पासिंग के बाद जीनोटाइपिंग की पुनरावृत्ति भी आनुवंशिक संशोधनों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

संशोधन और प्रोस्टेट ट्यूमर विच्छेदन और organoid पीढ़ी के निवारण
हम प्रोस्टेट ट्यूमर विशेषताओं में माउस परिवर्तनशीलता के लिए माउस मनाया है, यहां तक कि एक ही जीनोटाइप के साथ जानवरों के बीच. इसलिए, यहाँ वर्णित प्रोस्टेट विच्छेदन प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट संशोधन प्रत्येक माउस के लिए आवश्यक हो सकता है। इसके अलावा, metastatic ट्यूमर विच्छेदन शुरू करने से पहले इन घावों की गंभीरता की भविष्यवाणी करने के लिए मुश्किल है के बाद से जब adaptability आवश्यक है.

कुछ अवसरों पर, हम क्या संयोजी ऊतक प्रतीत होता है के साथ हमारे सेल गोली के अतिरिक्त संदूषण देखा है, यहां तक कि दोनों collagenase और trypsin के साथ पाचन के बाद. जब ऐसा होता है, हम AdDMEM F12 (+++) के कम से कम 2 एमएल में गोली resuspend और संयोजी ऊतक को दूर करने के लिए एक 40 डिग्री सेल छलनी का उपयोग करें। चूंकि मैट्रिक्स की ठोसीकरण दर में बहुत-से-लॉट परिवर्तनशीलता है, गुंबद ठोसीकरण के लिए समय को बढ़ाना या कम करना organoid मीडिया के आवेदन से पहले आवश्यक हो सकता है।

GEMMs का उपयोग करने में सीमाएँ
जबकि GEMMs पूर्व नैदानिक कैंसर के अध्ययन के लिए सबसे कठोर विधि हैं, इस दृष्टिकोण महत्वपूर्ण समय, खर्च, और प्रशिक्षण की आवश्यकता है. इसके अलावा, माउस के लिए माउस परिवर्तनशीलता कर सकते हैं, के रूप में मनुष्य के अध्ययन में, डेटा की व्याख्या जटिल.

3 डी सेल संस्कृति का उपयोग करने में सीमाएं
2 डी सेल संस्कृति की तुलना में, उत्पादन और organoid लाइनों को बनाए रखने में वृद्धि हुई समय और लागत की आवश्यकता होती है. उदाहरण के लिए, हमारे ट्यूमर organoid लाइनों हर 2-3 सप्ताह पारित कर रहे हैं, जबकि सेल लाइनों हर 2-3 दिनों में पारित किया जा सकता है. organoids की यह धीमी वृद्धि दर प्रयोगों को पूरा करने के लिए आवश्यक समय काफी बढ़ जाती है. Organoid संस्कृति मीडिया कई विशेष विकास कारकों और अभिकर्मकों, जो स्रोत के आधार पर महंगा हो सकता है शामिल हैं, इस प्रकार पैदा करने और organoids बनाए रखने पारंपरिक 2 डी सेल लाइनों की तुलना में अधिक महंगा है. अंत में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों मैट्रिक्स और अन्य अभिकर्मकों में बहुत मतभेद को देखा है - दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए organoid विकास में स्थिरता बनाए रखने के लिए एक चुनौती पैदा.

मौजूदा/ वैकल्पिक तरीकों के संबंध में 3 डी सेल संस्कृति का उपयोग करने में महत्व
पूर्व नैदानिक कैंसर अनुसंधान 2 डी सेल संस्कृति और सेल लाइन व्युत्पन्न xenograft मॉडल का प्रभुत्व रहा है. 2 डी में सेल विकास परिवर्तन की आवश्यकता है / अमरीकरण - इस प्रकार दोनों इन विट्रो और xenograft अध्ययन में 2 डी संस्कृतियों का उपयोग आम तौर पर unaltered सामान्य सेल लाइनों गैर कैंसर नियंत्रण के रूप में सेवा नहीं है. सामान्य उपकला व्युत्पन्न ऊतकों के 3 डी organoid संस्कृति में अनुसंधान के पिछले दशक अब गैर कैंसर उपकला ऊतकों कि कैंसर के ऊतकों से व्युत्पन्न अनुरूप organoids के लिए तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास के लिए अनुमति दी गई है. कैंसर organoids भी आगे ट्यूमर के विकास को समझने के लिए exografts स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, गैर कैंसर organoids नियंत्रण xenografts उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - जो 3 डी सेल संस्कृति के तरीकों से पहले संभव नहीं था16विकसित किया गया.

प्रोस्टेट कैंसर अनुसंधान में 3 डी सेल संस्कृति का उपयोग करने में महत्व
हाल के अध्ययनों में, organoids GEMM प्रोस्टेट ट्यूमर विशेषताओं recapitulate करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Dardenne एट अल शो कि organoids GEMMs से प्रोस्टेट ट्यूमर का उपयोग कर उत्पन्न है कि एक साथ ट्यूमर suppressor Pten की कमी है और MYCN oncogene overexpress organoids से प्रोस्टेट का उपयोग कर उत्पन्न की तुलना में अधिक से अधिक विकास की क्षमता थी नियंत्रण GEMMs. इसके अलावा, दोनों अनुक्रमण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से पता चला कि ट्यूमर organoids प्रोस्टेट ट्यूमर की अभिव्यक्ति प्रोफाइल recapitulated दोनों Pten की कमी है और MYCN21overexpressing. Blatner एट अल पता चलता है कि एक साथ प्रोस्टेट Speckle प्रकार BTB/PO$ प्रोटीन के एक oncogenic उत्परिवर्ती के overexpression (एसपीओ) और Pten के विलोपन GEMMs में tumorigenesis की दर बढ़ जाती है. जब प्रोस्टेट organoids उत्परिवर्ती SPOPoverexpress करने के लिए उत्पन्न किए गए थे , उनके प्रसार प्रोस्टेट organoids और वंश मार्कर अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने की तुलना में वृद्धि हुई थी मूल प्रोस्टेट ट्यूमर recapitulated22. साथ में, इन अध्ययनों से पता चलता है कि organoids GEMMS में प्रोस्टेट ट्यूमर विशेषताओं के आगे के अध्ययन के लिए एक इष्टतम मॉडल हैं.

Organoid संस्कृति भी प्रोस्टेट ट्यूमर कोशिकाओं के व्यक्तिगत subpopulations का आकलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. GEMM ट्यूमर है कि Pten और दोनों Pten और Trp53 ट्यूमर प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं में suppressors की कमी का उपयोग करना, अग्रवाल एट अल. आधार और luminal संतति में आंशिक कोशिकाओं, organoids के रूप में इन subpopulations प्रचारित, और आगे उनके विशिष्ट फीनोटाइप23की विशेषता थी . इस प्रकार 3 डी सेल संस्कृति का उपयोग कर, यह ट्यूमर कोशिकाओं जो प्रोस्टेट ट्यूमर खुद के भीतर बहुतायत में सीमित किया जा सकता है की subpopulations की विशेषता संभव है.

जैसा कि ऊपर वर्णित है, 3 डी सेल संस्कृति तकनीक सामान्य उपकला कोशिकाओं के विकास की अनुमति. इस प्रकार, एक क्रे ड्राइवर की कमी GEMMs से उत्पन्न प्रोस्टेट organoids इन विट्रो में क्रे रिकॉमनेस के प्रेरण द्वारा tumorigenesis की वास्तविक समय की निगरानी के लिए एक अद्वितीय मॉडल प्रदान करते हैं. वास्तव में, Dardenne एट अल. मूल्यांकन कैसे NMYC overexpression समय के साथ Pten हानि के संदर्भ में वृद्धि की क्षमता को प्रभावित करता है बाहर से ERT2-Cre व्यक्त करने और tamoxifen21के साथ इलाज . इसके अतिरिक्त, एण्ड्रोजन रिसेप्टर पर NMYC overexpression के प्रभाव (एआर), प्रोस्टेट कैंसर के लिए चिकित्सा का प्रमुख लक्ष्य, GEMMs21से उत्पन्न organoids में Cre recombinase के शामिल होने के बाद मूल्यांकन किया गया था. एक ही inducible Cre प्रणाली Blatner एट अल द्वारा प्रोस्टेट organoids में इस्तेमाल किया गया था को मापने के लिए कैसे उत्परिवर्ती SPOP के overexpression प्रोस्टेट कैंसर सेल प्रसार और एआर अभिव्यक्ति22को प्रभावित करता है . विशेष रूप से, इनविट्रो में क्रे अभिव्यक्ति को प्रेरित करने वाले प्रयोगों में वाहन-उपचार organoids के साथ एक अंतर्निहित गैर कैंसर नियंत्रण है।

प्रोस्टेट कैंसर अनुसंधान में 3 डी सेल संस्कृति का उपयोग करने में विशिष्ट सीमाएं
जबकि सामान्य उपकला कोशिकाओं के organoid विकास 3 डी सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग करने का एक लाभ है, क्षमता सामान्य organoids विकसित करने के लिए भी प्रोस्टेट कैंसर अनुसंधान अध्ययन में एक चुनौती प्रस्तुत किया है. जैसा कि हमारे प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया है, हमने प्रोस्टेट ट्यूमर से उत्पन्न लाइनों में सामान्य प्रोस्टेट organoids की वृद्धि देखी है जो कम आक्रामक हैं (चित्र 5)। इस घटना को संबोधित करने का एक तरीका यह है कि GEMMs से organoids उत्पन्न करने के लिए एक क्रे रिपोर्टर transgene व्यक्त, जैसे mT / फ्लोरिसेंट माइक्रोस्कोपी टमाटर और GFP की अभिव्यक्ति को देख कर ट्यूमर organoids के लिए सामान्य के सापेक्ष अनुपात का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, GFP अभिव्यक्ति शुद्ध प्रोस्टेट ट्यूमर organoid लाइनों उत्पन्न करने के लिए सॉर्ट organoid कोशिकाओं के प्रवाह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अग्रवाल एट अल एक क्रे रिपोर्टर के बिना GEMM प्रोस्टेट ट्यूमर से सामान्य उपकला कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक छँटाई विधि दिखा. वे बताते हैं कि उपकला सेल आसंजन आणविक (EpCAM) प्रोस्टेट ट्यूमर से सकारात्मक कोशिकाओं subpopulations में अलग नहीं किया जब या तो CD24 या Sca-1 सेल सतह मार्करों का उपयोग कर हल23 - इस प्रकार, इन मार्करों सामान्य बाहर करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ORGANoid पीढ़ी से पहले GEMM प्रोस्टेट ट्यूमर से प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं. हमारी प्रयोगशाला और दूसरों ने देखा है कि शर्तों के तहत प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं organoids फार्म या तो के लिए चयन करें या प्रोस्टेट बेसल उपकला कोशिकाओं की विशेषता वंश विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों को बढ़ावा देने के लिए दिखाई देते हैं. यह एक महत्वपूर्ण चुनौती है क्योंकि दोनों चूहों और मनुष्यों में प्रोस्टेट ट्यूमर मुख्य रूप से प्रकृति में luminal हैं, एआर व्यक्त, CK8, और अन्य luminal मार्करों, और शायद ही कभी इस तरह के p63 या CK5 के रूप में बेसल वंश मार्करों व्यक्त. हालांकि इस घटना को अभी तक विस्तार से प्रकाशित किया जाना है, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण से पता चलता है कि ए.आर. Ptenf/+ organoids में Ptenf/+ prostates21की तुलना में कमी आई है। प्रोस्टेट कैंसर organoids में बेसल उपकला कोशिकाओं की वृद्धि सवाल है कि क्या इन लाइनों वास्तव में प्रोस्टेट कैंसर का एक सटीक पूर्व नैदानिक मॉडल हैं कॉल.

जबकि प्रोस्टेट कैंसर organoids ट्यूमर जिसमें से वे पारंपरिक 2 डी संस्कृति से बेहतर प्राप्त कर रहे हैं मॉडल के लिए प्रलेखित किया गया है, वहाँ organoids के लिए संस्कृति में आनुवंशिक परिवर्तन से गुजरना करने की क्षमता है, विशेष रूप से कई मार्ग के बाद. वर्तमान में, हम किसी भी प्रकाशित अध्ययन है कि सहज आनुवंशिक उत्परिवर्तन, आनुवंशिक लाभ या नुकसान, या epigenetic परिवर्तन है कि प्रोस्टेट कैंसर organoids के लंबे समय तक पारित होने के बाद आम हैं प्रलेखित किया है के बारे में पता नहीं कर रहे हैं. एक परिणाम के रूप में परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए आनुवंशिक या epigenetic परिवर्तन है कि लंबे समय तक पासिंग के कारण हो सकता है, प्रयोगों जल्दी मार्ग से जल्दी organoids में प्रदर्शन किया जाना चाहिए (और lt;10) के रूप में अक्सर संभव के रूप में.

3 डी सेल संस्कृति के भविष्य के आवेदन
हालांकि यह सभी भविष्य अनुप्रयोगों है कि कैंसर अनुसंधान में 3 डी सेल संस्कृति का उपयोग कर विकसित किया जाएगा भविष्यवाणी करने के लिए असंभव है, वहाँ कई रास्ते हैं जो सबसे अधिक क्षमता है दिखाई देते हैं. 2 डी सेल लाइनों के साथ के रूप में, इन विट्रो आनुवंशिक संशोधन में बाहर ले जाने organoids में अपेक्षाकृत सरल है. या तो सामान्य या कैंसर organoids में विशिष्ट जीन को संशोधित करने ट्यूमरजनन, कैंसर प्रगति, और उपचार को नियंत्रित तंत्र के अध्ययन में कई संभावनाओं को खोलता है - खासकर जब आनुवंशिक रूप से संशोधित organoids organoid उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है विदेशी भाषा। organoids के आनुवंशिक संशोधन बहुत फायदेमंद है जब GEMMs एक विशिष्ट जीन के लिए मौजूद नहीं है या एक नया GEMM की स्थापना एक विशेष अध्ययन के दायरे से बाहर है.

कैंसर organoid संस्कृति भी नैदानिक अनुसंधान के लिए कई संभावित अनुप्रयोगों है. दोनों रोगियों और पशु मॉडल से प्रत्येक अंग प्रणाली के भीतर प्रासंगिक ट्यूमर subtypes के एक पुस्तकालय जल्दी से एक नई दवा या मौजूदा दवाओं के नए संयोजन की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में 3 डी सेल संस्कृति मुख्यधारा बन जाता है और दक्षता में वृद्धि होती है, व्यक्तिगत चिकित्सा के उद्देश्य के लिए रोगी व्युत्पन्न organoids पैदा करने के लिए सभी उपलब्ध दवाओं और संयोजन के परीक्षण के द्वारा प्रत्येक कैंसर रोगी के लिए दर्जी उपचार में मदद करने की क्षमता है दवाओं का उपयोग कर अपने या अपने व्यक्तिगत organoid लाइन16.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए वित्तीय संबंधों की जरूरत नहीं है.

Acknowledgments

लेखकस्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में केल्विन कू प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहते हैं कि एचईके293 कोशिकाओं को या तो हा-माउस नोगिन-एफसी या हा-माउस Rspo1-Fc के साथ stably transfected प्रदान करने के लिए। हम भी हमें अपनी प्रयोगशाला में फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की अनुमति के लिए डॉ डीन तांग धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम CA179907 द्वारा D.W.G. के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से समर्थित किया गया था. Roswell पार्क व्यापक कैंसर केंद्र में साझा संसाधनों स्वास्थ्य कैंसर केंद्र सहायता अनुदान CA016056 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA Sigma 25-053
1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles Becton Dickinson Z192430
10% neutral buffered formalin Sigma HT501128
32% paraformaldehyde Electron Microscopy Services 15714
A83-01 MedChemExpress HY-10432
Advanced DMEM/F12+++ Gibco 12634
Analytical balance Mettler Toledo 30216623
B27 (50x) Gibco 17504044
Collagenase II Gibco 17101015
Dissecting Board Thermo-Fisher 36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 Manufactured by Trevigen Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1 M) Sigma 25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF) PeproTech AF-100-15
L-glutamine (200 mM) Sigma 25-005
N-Acetyl-L-Cysteine Sigma A9165
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Precision balance Mettler Toledo 30216561
Scalpel #23 World Precision Instruments 504176
Scalpel Handle #7, 16 cm World Precision Instruments 500238
Single-edge carbon razor blade Fisherbrand 12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight World Precision Instruments 14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated World Precision Instruments 15915
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Wadosky, K. M., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W. Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (148), e59710, doi:10.3791/59710 (2019).

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