Summary
Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.
Abstract
Genleri değiştirmek için Homolog rekombinasyon dayalı Yöntemler önemli ölçüde biyolojik araştırma ilerletti. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMMs) memeli gelişimi ve hastalığı okumak için titiz bir yöntemdir. Laboratuvarımız, siteye özel CRE-loxP Rekombinaz sistemi ve prostat spesifik promotör kullanılarak bir veya birden fazla tümör bastırıcı genlerin ifadesinin bulunmadığı prostat kanseri (PCa) çeşitli GEMMs geliştirdi. Bu yazıda, öncelikle fare prostat tümörlerinin diseksiyonu üzerinde duruluyor, bu PCA gemms otopsi için yöntemi açıklanmaktadır. Son on yıl içinde geliştirilen yeni yöntemler, üç boyutta organ sistemlerine model olarak epitelyal türev hücrelerin kültürünü kolaylaştırmış durumdadır. Biz de detay bir 3D hücre kültürü yöntemi fare PCa GEMMs tümör organoids oluşturmak için. Klinik öncesi kanser araştırması 2B hücre kültürü ve hücre çizgisinin türetildiği veya hasta tarafından türetilen xenograft modellerinin hakimiyetindedir. Bu yöntemler tümör mikroçevre eksikliği, klinik öncesi çalışmalarda bu teknikleri kullanarak bir sınırlama. GEMMs daha fizyolojik-tümör ve kanser ilerlemesini anlamak için ilgilidir. Tümör nevuslardır kültürü, tümör mimarisini ve hücre soy özelliklerini tekrar eden bir in vitro model sistemidir. Ayrıca, 3D hücre kültürü yöntemleri tümör hücresi kültürlerine kıyasla normal hücrelerin büyümesini sağlar, 2D hücre kültürü tekniklerini kullanarak nadiren mümkündür. Kombinasyon halinde, ön klinik çalışmalarda GEMMs ve 3D hücre kültürünün kullanımı kanser biyolojisi anlayışımızı iyileştirmek için potansiyele sahiptir.
Introduction
1980 ' lerin sonlarında, Homolog rekombinasyon tarafından genler değiştirmek için yeteneği büyük ölçüde biyolojik sistemlerin çalışma Gelişmiş1. İndüklenebilir, doku veya hücreye özgü promotor sistemleri ve CRE-loxp gibi siteye özgü rekombinazlar, hem geçici olarak hem de uzamsal olarak2,3, genetik modifikasyonlar üzerinde kontrol kolaylaştırarak genetik çalışmalar gelişmiş 4' ü yapın. Bu genetik stratejilerin kombinasyonu deneysel model sistemleri5,6,7geniş bir dizi yarattı.
Genetik olarak tasarlanan fare modelleri (GEMMs), bireysel genler veya genler gruplarının memelin gelişimini ve hastalığı nasıl etkilediğini değerlendirmek için ayrılmaz bir araçtır. Klinik öncesi kanser araştırmalarında, GEMMs kanser gelişimi, progresyon ve tedavi8' i incelemek için en fizyolojik olarak alakalı ve titiz bir yöntemdir. Bizim laboratuar üreten ve kanser GEMMs karakterize uzmanlaşmıştır.
Amerika Birleşik Devletleri 'nde erkekler arasında en yüksek tanısı olmayan kutanöz kanser prostat kanseri (PCa). PCa olan hastaların çoğunluğu düşük riskli hastalık ve yüksek hayatta kalma olasılığı vardır, ancak hastalık ileri aşamalarında teşhis edildiğinde ya da hedeflenen hormonal tedavi agresif, non-tedavi edilemez PCa ilerlemesi indükler ise hayatta kalma oranları büyük ölçüde düşüş alt türler9,10. Laboratuvarımız bir veya daha fazla tümör bastırıcı genlerin floxed alleni kullanan GEMMs geliştirdi. Yeniden kombinasyon ve tümör bastırıcı gen ifade kaybı özellikle prostat oluşur çünkü biz CRE Rekombinaz aşağı aşağı probasin organizatör ile bir transgeni tanıtıldı sadece prostat epitelyal hücrelerde aktive11, 12. biz de bir CRE muhabiri transgene MT/mg denilen içeren bizim gemms yetiştirilen var, CRE ve yeşil floresan protein (Gfp) hücre içinde c-13Ile hücrelerde eksik hücrelerde domates floresan protein ifadesi indükler. Bu yöntemin sunumu ve temsilcimiz, laboratuvarımızda çalışmamızda GEMMs 'i gösterirken, bu protokol herhangi bir fare modelinden prostat kanseri organoidleri oluşturmak için kullanılabilir. Ancak, temsili sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak tartışıldığı gibi, bazı tümör özelliklerinin prostat kanseri nevuslardır üretimi için optimum olduğunu gözlemledik.
Son on yıl içinde, epitelyal orijinli dokulardan oluşan yeni kültür hücreleri yöntemleri, org sistemleri içinde vitro14,15modellik yeteneğimizde önemli gelişmelere yol açmıştır. "3D hücre kültürü" terimi, organoidlerin kurulması ve sürdürülmesinde yer alan tekniklere atfedilmiştir, bu da genellikle Organ-spesifik hücre sırlarıyla tahrik edilen ikincil mimarisi birleştiren hücrelerden oluşan yapılar olarak tanımlanabilir. özellikleri16. Bu yeni yöntemler, hücrelerin uzun vadeli büyüme için dönüşüm veya ölümsüzleştirme gerektirmeyen klasik 2D hücre kültüründen farklıdır; Böylece, normal hücrelerin 3D kültürler hastalıklı hücrelere kıyasla olabilir. Bu özellikle normal hücre kontrol kültürlerinin genellikle mevcut olmadığı kanser araştırmalarında değerlidir. Buna ek olarak, organoids kendiliğinden uygun farklılaşan hücre türleri ile ikincil doku mimarileri oluşturmak, onları daha iyi bir model sistemi 2D hücre hatları17daha kanser anlamak için yapmak. Laboratuvarımız bizim PCA gemms izole tümör sorunu 3D nevuslardır hatları yarattı bizim in vivo veri tamamlamak ve gemms mümkün olmayacaktır deneyler gerçekleştirmek için.
Bu yazıda, farklı fare prostat lobları ve metastatik lezyonların diseksiyonu da dahil olmak üzere PCA gemms tam otopsi için yazılı ve görsel protokoller sunuyoruz. Daha önce Drost ve Al tarafından yayınlanan bir protokol temelinde fare prostat tümörlerinden organoidler oluşturmak için adım adım bir yöntem tarif ve gösteriyoruz. normal fare prostat epitelyal dokusundan organoidler türetmek için18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan hayvan prosedürleri, laboratuvar hayvansal kaynaklar bölümü 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıABUC) onayı ile, Roswell Park kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, New York 'ta yapıldı.
Not: Organoidlerin nesil için Ayrıca birlikte prostat veya prostat tümörlerinin yalıtmak için disseke erkek fareler en az cinsel olgunluk yaşına ulaşmalıdır-yaklaşık 8-10 hafta yaş. Belirli yaş fareleri çalışmalar arasında farklılık gösterebilir. Yaş seçerken göz önünde bulundurulması gereken bazı faktörler arasında, prostat hücresi popülasyonlarında yaşa bağlı değişiklikler, belirli Promoter odaklı CRE transgenlerin yaşa bağımlı ifadesi ve belirli bir GEMM 'de prostat tümörü ilerlemesi bulunmaktadır.
1. fare ProstateTumor ve metastatik tümörler diseksiyon ve görüntüleme
- Hazırlık
- Gerekli steril diseksiyon araçlarını edinin. 15 cm Cetvelli, hassas denge, analitik denge,% 70 etanol ile sprey şişesi, phospho-tamponlu tuzlu (PBS) ve kağıt havlular ile temiz steril yüzeyde sahne diseksiyon alanı.
-
Nevuslardır nesil için kullanılmamalıdır visseral organlar ve kemikler için fikreatif çözümlerin hazırlanması
- Viseral organlar için: PBS 'de% 4 civarında formaldehite (PFA) hazırlayın. Bir fare için,% 4 PFA 20 ml, 2 15 ml konik borular içine kısım yapmak ve kullanım kadar oda sıcaklığında tutun.
- Uzun kemikler için: aliquot 10 mL önceden yapılmış 10% nötr tampon formalin (NBF) 1 15 mL konik tüp ve kullanım kadar oda sıcaklığında tutun.
- Tedavi edilmeyen 10 cm 'lik yemekleri elde et ve steril olmayan PBS ile doldur-Bunlar, Diseksiyon mikroskobu kullanarak ince diseksiyon sırasında organlar için geçici konteynerler olarak hizmet edecektir.
Not: Steril aletler organoidler oluşturmak için diseksiyon dokularda kullanılır. Steril olmayan aletler, arka ekstremite ilk kesi ve diseksiyon için kullanılır.
- Ötenazi ve ilk kesi
- 5 dakika boyunca 2,0 L/dk akış hızını kullanarak Co2 boğulma tarafından fareyi ötenere. kafesten fareyi çıkarın ve servikal dislocation gerçekleştirin. Fare vücut ağırlığı ve kaydını ölçmek için hassas dengesini kullanın.
- Bir kağıt havlu üstüne fareyi yerleştirin ve fare kafası araştırmacı uzak bakan ile diseksiyon yüzeyi ventral tarafı yukarı yönlendirmek. Onun ekstremite dışarı uzanan ve bir tek kullanımlık iğne ile forepaws ve arka pençeleri her piercing tarafından tahta için fareyi Affix.
- Bir sprey şişesi kullanarak, 70% etanol ile fare kürk ikiye katlar. Non-Steril Diseksiyon makas ve düz forseps kullanarak, fare penisinin hemen üstünde çimdik ve sadece kürk yoluyla küçük bir kesi yapmak.
- Sadece kürk yoluyla fare boynuna kesi orta çizgi devam edin. Sadece kürk yoluyla fare ventral düzlemden ilk kesi noktasından bilateral kesikler olun.
- Kürkü kavrayın ve dikkatle farenin derisinden çekin. Hem karın hem de torasik boşlukların erişimine izin vermek için kürkü tahta kadar sabitleyin.
- Erkek ürogenital sistemin en bloktan çıkarılması
- Steril Diseksiyon makas ve düz forseps kullanarak, dikkatle rektum üzerinde 0,75 cm hakkında cilt üzerinden kesilmiş. Karın boşluğunda herhangi bir organ rahatsız etmeden göğüs kafesi kadar kesi orta çizgi devam edin. Dikkatle cilt uzağa çekin ve tüm karın boşluğu açığa çıkarmak için tahta pin.
Not: Bu dokuların organoidler oluşturmak için kullanılacaktır gibi, bu enstrümanlar hazırlama alanında fare veya herhangi bir yüzey dışında dokunmak izin vermez. - Şekil 1A'daki diyagrama göre ürogenital sistem ve diğer organları incelemek, sayılar ile organları fare kaldırılacak sırasını gösteren.
- Mesane bulmak, sonra ya sol veya sağ yağ Pad kavramak ve testis ortaya çıkarmak için yukarı çekin. Dikkatle ürogenital bölgenin geri kalanından testis uzaklaştırın ve bir kenara koyun. Diğer tarafta aynı prosedürü yapın.
Not: En iyi doku kalitesini elde etmek ve prostat tümörlerinin ayrıntılı tümör karakterizasyonu, tüm ürogenital bölgenin fare en bloku19' dan kaldırılmasını gerektirir. Ürogenital bölgenin ilk olarak kaldırılması önerilir (Şekil 1A). - Mesane kavramak ve dikkatle böylece ürogenital bölgenin birlikte kaldırma, altında üretra açığa çekin. Mesane tutarak, böylece dorsal prostat alt karşı ve üretra kesme makas yönlendirmek. Tüm ürogenital bölge daha sonra Karın boşluğundan serbest bırakılacak.
- Ürogenital bölgeyi PBS ile dolu 10 cm 'lik bir çanak içine koyun. Hala idrar ile dolu ise, küçük bir kesi yaparak mesane drenaj. Analitik denge kullanarak, ürogenital sistem ve kayıt tartmak.
- Steril Diseksiyon makas ve düz forseps kullanarak, dikkatle rektum üzerinde 0,75 cm hakkında cilt üzerinden kesilmiş. Karın boşluğunda herhangi bir organ rahatsız etmeden göğüs kafesi kadar kesi orta çizgi devam edin. Dikkatle cilt uzağa çekin ve tüm karın boşluğu açığa çıkarmak için tahta pin.
- Pelvik lenf nodları, dalak, karaciğer, böbrek, akciğer, Tibia ve femur ekstraksiyonu
- Ürogenital Sistemin çıkarılması, Ürogenital Sistemin hemen arkasında konumlandırılmış Pelvik lenf nodları ortaya çıkarır (Şekil 1A) ve omurganın her iki tarafında. Lenf nodları sadece metastatik lezyonlar içeriyorsa veya lokal inflamasyon varsa görünür olacaktır. Lenf düğümünün altında düz forseps yönlendirmek ve lenf düğümü kaldırmak için yukarı çekin. Diğer tarafta aynı prosedürü yapın.
- Rektum ile düz forseps ve kesme tutun. Mezenterik lenf nodlarında metastatik lezyonlar arayan, tüm kolon ve ince bağırsak çözmek için rektum çekin. Tüm ileum kaldırıldığında, mide ortaya çıkarmak için duodenum üzerinde çekmeye devam edin. Tamamen mide kaldırmak ve atmak için özofagus kes. Lenf nodlarında metastatik lezyonlar gözlemlenirse, bağırsak ve depolardan 10 cm 'lik bir tabak içinde dikkatlice uzaklaştırın.
- Karnının açığa çıkması ve çıkarılması karının dorsal tarafındaki dalağı çekecektir (Şekil 1A). Dalağı çıkarın ve 4% PFA yerleştirin. Dalak, son derece hücresel olduğu için hemotoxylin için bir boyama kontrolü olarak hizmet vermektedir.
Not: Nevuslardır nesil için kullanılmamalıdır visseral dokularda gece% 4 PFA, PBS ile yıkanmış ve daha sonra% 70 etanol yerleştirilir sabitlenir. - Karın üst kesiminde karaciğeri çıkarın (Şekil 1A). Karaciğer metastatik yük dayanarak, bireysel loblar dissected olabilir, ya da tüm karaciğer dikkatle diyafram boyunca kesme tarafından kaldırılabilir. (Şu anda diyaframı kesmeyin). PBS 10 cm çanak karaciğer yerleştirin.
- Karaciğerin çıkarılması, omurganın her iki tarafındaki böbrekleri tamamen açığa çıkarır (Şekil 1A). Böbrekler-böbrek lenf nodları ile birlikte, düğümler metastatik lezyonlar varsa-böbrek altında düz forseps yerleştirerek ve yukarı çekerek. Diğer taraf için aynı prosedürü yapın.
- Torasik boşluğu açığa çıkarmak için, ribcage boyunca dikkatle diyaframı keser. Diyaframın delici torasik boşlukta negatif basıncı serbest bırakacaktır ve kalp ve akciğerleri açığa (Şekil 1A).
- Sternum tutun ve daha fazla torasik boşluğu açmak için yukarı çekin. Torasik lenf nodlarında metastatik lezyonlar için kaburga kafesi boyunca torasik boşluğun ventral yüzüne dikkat edin ve varsa, parçala.
- Hala sternum tutarak, kalp ve akciğerleri erişmek için ventral kaburga kafesi kesip. Kalbi tutun, yukarı çekin ve akciğerlerin altına kesin. Tam olarak kalp ve akciğerleri kaldırmak için, tüm anterior kan damarlarını ve trakea kesip. Doku PBS yerleştirin ve dikkatle akciğer dokusu veya akciğer metastatik lezyonlara zarar vermeden kalp çıkarın.
- Steril olmayan düz forseps ve Diseksiyon makas alın ve femur başında arka bacak kesti. Dikkatle femur kavramak ve kürk arka bacak çıkarın.
- Arka bacak bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve arka pençe kavramak. Tek kenarlı jilet kullanın hurda/Tibia ve femur tüm kas ve bağ dokusu uzağa kesti. Patella posterior kesme ve arka pençe kaldırarak Tibia kaldırmak tarafından Tibia femur çıkarın. Tibia ve femur 10% NBF yerleştirin. Diğer tarafta aynı prosedürü yapın.
Not: Metastatik lezyonlar için fare uzun kemikleri incelemek amacıyla, fibula bozulmamış olması gerekmez. Uzun kemikler, bir hafta boyunca% 10 NBF 'de düzeltilecektir, ardından nötr EDTA çözümü20' yi kullanarak decalcified olacaktır. Üç hafta sonra, kemikler% 70 etanol için transfer edilecektir. - Arka ekstremite çıkardıktan sonra, gelecek Genotipleme için bir kulak veya kuyruk kesme alın. Fare karkas ve tüm doku sabit veya nevuslardır nesil için kullanılan değil atın.
- Prostat tümörünün diseksiyonu
Not: Fare prostat lob diseksiyon sadece bir diseksiyon mikroskop kullanılarak elde edilebilir19. Ancak, prostat tümörü yükü o kadar yüksek olabilir ki, bireysel lob 'lar ayırt edilemez ve diseksiyon mikroskop olmadan yapılabilir. Yine de, bireysel prostat lob diseksiyonu için tam protokol aşağıda açıklanmıştır.- Ürogenital bölgeyi, bir Diseksiyon mikroskobu altında 10 cm 'lik bir PBS çanak içine yerleştirin ve sidik tarafını, araştırmacıya karşı karşıya gelen mesane ve seminal veziküller ile yönlendirmek. Ürogenital bölgenin tüm manipülasyon steril aletler kullanılarak yapılmalıdır.
- Prostat tümörünün genel fenotipini değerlendir-büyük ihtimalle, PCa GEMMs 'de sıvı dolu veya katı bir tümör gözlenir (Şekil 2a, B).
Not: Akışkan dolu tümörlerde sıklıkla anterior prostat bölgesinde yer almaktadır (Şekil 2A). Sıvı dolu tümörler, öncelikle bağ dokusu ile yetersiz epitelyal bileşenlerden oluşur-böylece bu tümörler tümör epitelyal hücrelerinin düşük sayıda nedeniyle nevuslardır nesil için optimum değildir, temsili sonuçlarında tartışılacaktır Bölüm. - Sıvı dolu tümörler varsa, tümör küçük bir delik poke. Ürogenital bölgeyi PBS 'nin yeni 10 cm 'lik bir tabağına yerleştirin.
- Dominant el olmayan baskın el ve kavisli forseps düz forseps bir çift alın. Ürogenital bölgeyi dorsal yüzüne çevirin. Proksimal prostat bölgesini arayın (Şekil 1B), hangi üretra pembe/kırmızı renk ile tespit edilebilir. Üretra kavramak ve eğri forseps ile ürogenital doku işlemek için sıkıca tutun.
Not: Prostat diseksiyonu sırasında, her zaman mesane konumunu not alın, bu bireysel prostat lob bulmak için en basit yoldur (Şekil 1B).
- Ürogenital bölgeden prostat olmayan dokuların çıkarılması
- Ürogenital bölgenin dorsal yüzünde hala iken, seminal vezikül tabanı bulun. Dikkatle seminal vezikül çıkarın ve atın. Aynı prosedürü karşı tarafta gerçekleştirin.
Not: Bu prostat diseksiyonu ile müdahale yapışkan ve opak salgıları sıvı serbest bırakacaktır gibi, seminal vezikül delinme kaçının. Seminal vezikül delinmiş ise, kalan ürogenital bölgeyi taze PBS ile yeni 10 cm ye aktarın. - Vas deferens ve forseps kavisli tarafı kullanarak mümkün olduğunca çok yağlı ve bağ dokusu çıkarın ve atın.
- Hala sıkıca üretra/proksimal prostat bölgesi tutarak, ince, sivri makas bir çift kullanın üretradan mesane kaldırmak için.
- Ürogenital bölgenin dorsal yüzünde hala iken, seminal vezikül tabanı bulun. Dikkatle seminal vezikül çıkarın ve atın. Aynı prosedürü karşı tarafta gerçekleştirin.
- Bireysel prostat lobları izolasyonu
- Anterior prostat bulun (Şekil 1B). Düz forseps ile proksimal prostat bölgesi/üretra sıkıca tutmak için emin olun. Ön prostat bölgesini doğrudan forseplerin kavisli tarafı ile dokuyu hemen tutarak ve mesane ve prostatın geri kalanından sıkıca çekerek çıkarın. Dokuyu PBS 'ye yerleştirin.
Not: Tüm prostat bölgeleri için, tümörün boyutuna bağlı olarak dokuyu çıkarmak için diseksiyon makası gerekebilir. - Ventral prostat bölgesini bulun (Şekil 1B). Ventral prostat bölgesini adım 1.5.7 aynı şekilde çıkarın.
- Diseksiyon bu noktada, sadece lateral ve dorsal prostat bölgeleri mevcut olmalıdır, proksimal prostat bölgesi hala düz forseps tarafından kavrayarak ediliyor iken. Lateral ve dorsal prostat bölgelerini değerlendir (Şekil 1B). Lateral bölge dorsal bölgeden ayırt edilebilir ise, adım 1.5.7 açıklandığı gibi lateral prostat bölgesini çıkarın. Aynı prosedürü karşı tarafta yapın.
- 1.5.7 adımda açıklandığı gibi dorsal prostat bölgesini çıkarın. Proksimal prostat bölgesini% 4 PFA olarak yerleştirin, üretranın kas dokusu içindeki yapısı nevuslardır nesil için uygun değildir.
- Anterior prostat bulun (Şekil 1B). Düz forseps ile proksimal prostat bölgesi/üretra sıkıca tutmak için emin olun. Ön prostat bölgesini doğrudan forseplerin kavisli tarafı ile dokuyu hemen tutarak ve mesane ve prostatın geri kalanından sıkıca çekerek çıkarın. Dokuyu PBS 'ye yerleştirin.
2. prostat tümör dokusundan 3D Organoidlerin üretimi
Not: Şekil 3 , tümör organoidlerin oluşturulması için prosedürün resimsel bir açıklamasını gösterir.
- Hazırlık
- Aşağıdaki değişikliklerle drost ve al.18 ' e göre fare prostat nevuslardır medya hazırlayın. Noggin ve r-Spondin için rekombinant proteinler yerine şartlanma ortamını kullanın ve hem Noggi hem de ar-Spondin-Klima ortamı için% 10 yerine% 1 (v/v) oranında son konsantrasyon kullanın.
Not: Ha-Mouse noggin-FC veya ha-Mouse Rspo1-FC ile stabil transfekte HEK293 hücreler sırasıyla noggin-veya R-spondin-Klima orta üretmek için kullanılır. Bu hücre hatları Stanford Üniversitesi 'nde Calvin Kuo Laboratuvarı 'ndan bir hediye. - 5 mg/ml 'lik son konsantrasyona gelişmiş dmem/F12 (+ + +) medya ile 20 mg/ml kolajenaz II seyreltilerek 15 ml 'lik bir tüpte sindirim solüsyonu hazırlayın. 10 μM son konsantrasyonda kolajenaz II çözüme Y-27632 kaya inhibitörü ekleyin.
Not: Sindirim tamponunun dokuya oranı 1 mL ila 50 mg 'dır ve Drost ve al.18' e göre kullanılır.
- Aşağıdaki değişikliklerle drost ve al.18 ' e göre fare prostat nevuslardır medya hazırlayın. Noggin ve r-Spondin için rekombinant proteinler yerine şartlanma ortamını kullanın ve hem Noggi hem de ar-Spondin-Klima ortamı için% 10 yerine% 1 (v/v) oranında son konsantrasyon kullanın.
- Tümör dokusunun mincing ve sindirimi
- Hücre kültürü kaputunda, prostat tümör dokusunu steril bir 10 cm kültür yeminde yerleştirin, nekrotik dokuyu kesip atın.
- Kalan prostat tümör dokusunu 1 mm3 küpler halinde steril kavisli forseps ile doku parçaları tutarak ve Diseksiyon makas ile kesme Mince.
- The 15 mL tüp içinde kıyılmış tümör parçaları koyun sindirim tampon ile forseps kavisli tarafı ile onları scooping tarafından. 37 °C ' de, 1,5 ila 2 saat sallayarak tümör dokusunu sindirin. her 20 dakikada bir sindirim ilerlemesini kontrol edin.
Not: Şu anda,-20 °C depolama ve buz üzerinde çözülme en az 2 mL matris çıkarın. Matris 1 ml plakaya yaklaşık 3 h çözülmeye alacaktır. - Doku sindirimi sonrası, 175 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika santrifüj tüpü hücre Pelet formu.
- Supernatant çıkarın, hücre peletini gevşetmek için tüp Flick, ve 10 μM Y-27632 kaya inhibitörü ile tamamlayıcı ön ısıtılmış tripsin 1 ml hücre Pelet pelletini. Tüpü 5 dakika boyunca 37 °C su banyosuna koyun.
- İnkübasyon sonrası, standart P1000 ucu ile 5 kez yukarı ve aşağı pipet. Başka bir 5 dakika için 37 °C su banyosu için tüp geri dönün ve adım 2.2.6 tekrarlayın.
Not: Prosedürün Şu anda, 55 °C ' lik kuluçvörü içine koyarak steril 6-iyi hücre kültürü çanak sıcak.
- Matris içinde hücreler ve Resuspension sayma
- 9 mL soğuk AdDMEM/F12 (+ + +) ekleyerek hücreleri yıkayın ve 175 x g 'de tüpü 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler.
- Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın, peletin gevşetmek için tüp Flick, ve soğuk AdDMEM/F12 10 mL ekleyerek hücreleri tekrar yıkayın (+ + +). 4 °C ' de 5 dakika için 175 x g 'de tüpü Santrifüjü.
- Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın, peletin gevşetmek için tüp Flick, hücreleri pelletini 1 ml addmem/F12 (+ + +), ve Standart prosedüre göre bir hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını saymak.
- Yedi-sekiz kubbeler bir iyi bir 6 iyi yemek zaman organoids matris içinde bir drop-Wise moda kaplama uygun . Yaklaşık 200 μL matris 7-8 kubbeleri üretecektir. Gelecekteki Deneysel amaçlar için kaç organoidin kuyuya ihtiyaç olduğunu karar verin ve gerekli matris hacmini hesaplayın. Daha sonra, 1,0 x 106 hücre/ml matrisin son konsantrasyonuna sahip olmak için gereken hücre içeren çözümün hacmini hesaplayın.
- Hücreleri saydıktan sonra, 175 x g 'de 4 °c ' de 5 dk santrifüjler. Supernatant kaldırmak, peletin gevşetmek için tüp Flick ve adım 2.3.4 hesaplanan matris hacminde hücreleri pelletini.
Not: Matrix sadece 4 °C ' de sıvı şeklinde kalır; Matris stok tüpleri ve matris hücre çözümlerini her zaman buzda saklayın.
- Kaplama matris kubbeleri ve medya uygulaması
- Kabarcık tanıtmadan hücreleri eşit şekilde dağıtmak için matris hücresi çözümünü P200 pipet ile karıştırın. 55 °C ' lik kuluçoradan 6-kuyu kültürü tabağı çıkarın.
- Dikkatle pipet 200 μL matris hücre çözeltisi ve hızlı bir şekilde kubbeler oluşturmak için çözüm bırakın.
- 2.4.2 adımı tekrarlayın. Matris hücresi çözeltisi hacmi harcanıncaya kadar. Kubbeler, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca katılaşma sağlar.
- 6-well çanak ters çevirin ve 20 dakika boyunca Katılaşma devam etmek için bir 37 °C kuluçl içine çanak koymak.
- İnkübasyon sonra, her kuyu için 2 ml fare prostat nevuslardır medya ekleyin. 10 μM son konsantrasyonu 1 nM ve Y-27632 kaya Inhibitörü son konsantrasyon için her iyi sentetik androjen R1881 ekleyin. Dikkatlice karıştırın ve plakayı 37 °C ' lik bir kuluçinatörün içine yerleştirin.
Not: Nevuslardır kültür medyanın 10 μM Y-27632 kaya inhibitörü ile sadece 1 hafta sonra nevuslardır nesil ile takviye edilmesi gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ön prostat bölgesinde büyük bir sıvı dolu primer prostat tümörü olan bir fare temsili otopsi görüntüler Şekil 2agösterilir. Buna karşılık, Şekil 2B, bireysel prostat bölgeleri ayırt edilemez büyük bir katı primer prostat tümörü olan bir fare temsili nekropsy görüntüleri gösterir. Floresan diseksiyon görüntüleri aynı katı prostat tümörü gösterir Şekil 2B ifade Gfp, bu tümörler hücre ifade CRE gösterir (Şekil 2C). Mesane gibi probasin, ifade etmez doku, açık domates ve böylece CRE ifade etmez (Şekil 2C). Şekil 2B 'den gelen fareden gelen karaciğer ve akciğerler, primer prostat tümöründen kaynaklı olduğunu gösteren ve domates (Şekil 2C) ifade eden normal dokuyla çevrili olan, Gfp 'yi dile getiren metastaz tümörü var ). Son olarak, bu fareden Pelvik lenf nodu, bu metastatik tümörlerin Bu organı aşmadığını ve normal doku kalmaz (Şekil 2C) olduğunu belirten, domates değil, Gfp ifade eder.
Biz katı bir prostat tümörü oluşturulan organoids Şekil 4 ' te görüntüler gösterir. 1. gün 'de, temsili faz kontrast görüntülerde görüldüğü gibi küçük organoidler şekillendirilmesi. 1. günde floresan görüntüler, hem domates hem de Gfp hücrelerinin tümör nevuslardır kültüründe (oklar) bulunduğunu gösterir. Ancak, 7. gün prostat tümörü organoidlerin tamamen oluşduğunda, bu organoidler domates değil, GFP ifade ediyorlar. Bu veriler, bu organoidlerin normal epitelyal hücrelerden değil, CRE 'i ifade eden tümör hücrelerinden kaynaklandığını göstermektedir. Bu tümör organoids sadece GFP-pozitif biz geçiş 1 ve 2 kültürümüzü genişletmek gibi devam ediyor.
Şekil 5' te, sıvı dolu prostat tümöründen üretmemiz gereken organoidlerin görüntülerini gösteriyoruz. 1. gün 'de küçük organoidler şekillendiriliyor ve floresan görüntüler, organik kültürde hem domates hem de GFP ifade hücrelerinin mevcut olduğunu gösterir — katı bir prostat tümöründen oluşturulan organoidler için 1. Ancak, sıvı dolu prostat tümöründen gelen organoidler, 7. günde GFP veya Tomato 'ya ifade edilir — organoidlerin CRE 'ye ifade etmeyen hücrelerden oluştuğunu gösterir. Bu model geçiş 1 ve geçiş 2, kültür hem domates ve GFP ifade organoids vardır devam ediyor. Çizgi normal epitelyal organoidler ve tümör organoidlerin bir karışımı olduğu için bu organoidlerin daha fazla analizi ciddi olarak sınırlıdır. Biz sıvı dolu prostat tümörlerinin tümör organoidlerin üretilirken basit olduğunu düşünüyoruz, çünkü normal prostat epitelyal hücrelerinin daha büyük bir yüzdesi vardır. Normal prostat epitelyal hücreleri ve prostat kanseri hücrelerinde organoidler oluşturduktan sonra, sıvı dolu prostat tümörlerinin oluşturduğu çizgiler normal ve kanser organoidlerin bir karışımıdır. Biz Gfp-pozitif hücreler için akış sıralama ve hücreler bu nüfusundan organoids üreten sıvı dolu prostat tümörlerden saf tümör nevuslardır hatları elde. Katı prostat tümörleri öncelikle tümör hücrelerinden oluşur, bu nedenle bu tümörlerden oluşturulan organoidler daha önce GFP için sıralama yapmadan kanser organoidlerin daha saf bir nüfusu vardır.
Şekil 1 : Prostat kanseri için önerilen diseksiyon sırası (PCa) genetik olarak tasarlanan fare modelleri (GEMMs) ve fare prostat anatomisi. (A) büyük organları PCA gemm 'den ayırabilmek için protokolimizde önerdiğimiz sipariş. 1. ürogenital bölge. 2. Pelvik lenf nodları. 3. dalak. 4. karaciğer. 5. böbrekler. 6. akciğerler. 7. Tibia ve femur. (B) fare ürogenital bölge ve prostat anatomisi haritası. 12 haftalık farın floresan diseksiyon görüntüleri probasin-CRE ve MT/mg CRE muhabiri transgeni ifade ediyor. Mesane (BL), seminal veziküller (SV), anterior prostat (AP), ventral prostat (VP), lateral prostat (LP), dorsal prostat (DP) ve proksimal prostat (PP). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Prostat kanseri temsili diseksiyon görüntüleri (PCa) genetik olarak tasarlanan fare modelleri (GEMMs). (A) ürogenital bölgenin çıkarılması ve ürogenital bölgenin sıvı dolu prostat tümörü ile önce karın boşluğu. (B) ürogenital bölgenin ve ürogenital bölgenin çıkarılmasından önce, katı bir prostat tümörü olan karın boşluğu. (C) metastatik lezyonlar geliştiren PCA gemm 'den sağlam bir prostat tümörü, karaciğer, akciğer ve pelvik lenf düğümünün temsili domates ve Gfp floresan görüntüleri. Ölçek çubuğu = 5 mm. mesane (BL), anterior prostat (AP) ve dorsal prostat (DP). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Prostat tümör organoidleri oluşturmak için protokol akış şeması. Prostat tümörü diseksiyon sonra, 1 mm parça içine doku kıyma. Collagenase 'de tümör parçalarını sindirin, hücreleri toplayın ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tripsin içinde sindirin. Hücreleri saydıktan sonra, 1,0 x 106 hücreli/ml hücre konsantrasyonu için gerekli matris hacminde resüpend. Bir damla-Wise yöntemi kullanarak çanak plaka kubbeler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Sağlam bir prostat tümöründen fare prostat tümörü organoidlerin nesil temsili görüntüler. Temsilci faz kontrast, domates, ve GFP floresan görüntüler gün 1, gün 7, Passage 1, ve Passage 2 organoids bir katı fare prostat tümörü oluşturulan. Ölçek çubuğu = 100 μm. oklar floresan görüntülerde bireysel hücreleri gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Sıvı dolu bir tümörden fare prostat tümörü organoidlerin nesil temsili görüntüler. Örnek faz kontrast, domates, ve GFP floresan görüntüleri gün 1, gün 7, Passage 1, ve Passage 2 organoids bir sıvı dolu fare prostat tümörü oluşturulan. Ölçek çubuğu = 100 μm. oklar floresan görüntülerde bireysel hücreleri gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prostat tümörü diseksiyonu ve nevuslardır üretimi için protokol içinde kritik adımlar
Prostat dışı doku ve fare prostat tümörünün ince diseksiyonu kaldırılması hem prostat olmayan epitelyal hücreler ve normal prostat epitelyal hücreler organoidler oluşturacaktır beri kanser organoidlerin optimum nesil için çok önemlidir. Katı prostat tümörlerinde özellikle, uygun hücrelerin sayısını azaltacak nekrotik doku ile kontaminasyon kaldırmak için uygun tümör alanlarını izole etmek çok önemlidir. Nevuslardır nesil sırasında, kolajenaz ile doku sindirimi özenle izlenmelidir, kolajaz uzun süreli pozlama hücre viability sınırlandıracak gibi. Kanser gemms türetilen organoidler ile, tüm transgenler ve fare içinde tasarlanan değiştirilmiş allellerin organoidler mevcut olduğundan emin olmak için her satır tam genotip için çok önemlidir. Uzun süreli geçişte sonra Genotipleme tekrarı da genetik değişikliklerin sürdürülmesini sağlamak için gereklidir.
Prostat tümörü diseksiyonu ve nevuslardır üretimi ile ilgili değişiklikler ve sorun giderme
Biz aynı genotip hayvanlar arasında bile, prostat tümör özellikleri fare değişkenliği fare gözlemledik. Bu nedenle, burada açıklanan prostat diseksiyonu protokolüne özel değişiklikler her fare için gerekli olabilir. Buna ek olarak, diseksiyon başlamadan önce bu lezyonların şiddetini tahmin etmek zor olduğundan metastatik tümörlerin diseksiyon sırasında uyum gereklidir.
Birkaç kez, biz bağlayıcı doku gibi görünüyor ne ile hücre Pelet aşırı kontaminasyon gözlemledik, hem kolajenaz ve tripsin ile sindirim sonra bile. Bu durumda, biz en az 2 ml addmem F12 (+ + +) içinde Pelet pelletini ve bağlantı dokusu kaldırmak için bir 40 μm hücre süzgeci kullanın. Matrisin katılaşma oranındaki çok-çok değişkenlik olduğundan, nevuslardır medyanın uygulanmadan önce kubbe katılaşma süresini artırarak veya azaltarak gerekli olabilir.
GEMMs kullanma sınırlamaları
GEMMs klinik öncesi kanser çalışmaları için en titiz yöntemdir, ancak bu yaklaşım önemli zaman, gider ve eğitim gerektirir. Buna ek olarak, fare değişkenliği fare, insanların çalışmada, veri yorumu zorlaştırmak olabilir.
3B hücre kültürünü kullanmanın sınırlamaları
2D hücre kültürü ile karşılaştırıldığında, üreten ve nevuslardır hatları bakımını artırmak zaman ve maliyet gerektirir. Örneğin, tümör nevuslardır hatlarımız her 2-3 haftada bir paslanmış olmakla beraber, hücre hatları her 2-3 günde bir geçiş yapabilir. Bu daha yavaş büyüme oranı organoids deneyler önemli ölçüde tamamlamak için gereken süreyi artırır. Organoid Kültür medya çeşitli özel büyüme faktörleri ve reaktifler içerir, hangi kaynağa bağlı olarak pahalı olabilir, böylece üreten ve organoids bakımını geleneksel 2D hücre hatları daha pahalıdır. Son olarak, laboratuvarımız ve diğerleri matris ve diğer reaktifler çok farklar çok gözlenen-uzun vadeli deneyler için nevuslardır büyüme tutarlılığı korumak için bir meydan okuma.
Mevcut/alternatif yöntemlere göre 3B hücre kültürünü kullanmanın önemi
Klinik öncesi kanser araştırması 2D hücre kültürü ve hücre çizgisinin türeyen xenograft modelleri tarafından hakim olmuştur. 2D hücre büyümesi dönüşüm/ölümsüzleştirme gerektirir-böylece 2D kültürler kullanarak hem in vitro ve xenograft çalışmaları genellikle olmayan kanser kontrolleri olarak hizmet etmek için değiştirilmemiş normal hücre hatları yok. Normal epitelyal türev dokularda 3D nevuslardır kültüründe araştırma son on yıl şimdi kanser dokusundan türetilen benzer organoidler karşılaştırmak için kullanılabilecek kanserli olmayan epitelyal dokularının büyümesi için izin verdi. Kanser organoids da daha fazla tümör gelişimini anlamak için ksenogreft kurmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, non-Cancer orgoids kontrol ksenogreft oluşturmak için kullanılabilir-3D hücre kültürü yöntemleri geliştirilmeden önce mümkün değildi16.
Prostat kanseri araştırma 3D hücre kültürü kullanarak önemi
Son çalışmalarda, organoids GEMM prostat tümör özellikleri reapitma için kullanılmıştır. Dardenne ve al. organoids aynı anda tümör bastırıcı PTEN eksikliği ve MyCn onkogeni overexpress içinde gemms prostat tümörlerin kullanılarak oluşturulan göstermek organoids daha fazla büyüme potansiyeli vardı ayrıca birlikte prostat kullanılarak oluşturulan kontrol GEMMs. Buna ek olarak, her iki sıralı ve immünhistokimya tümör organoidlerin, hem PTEN eksikliği hem de MyCn21' i aşırı dile getiren prostat tümörlerinin ifade profillerini tekrar yeniden gösterdiğini göstermiştir. Blattner ve al. speckle tipi BTB/poz protein (SPOP) bir Onkojenik mutant eşzamanlı prostat ekspresyonu göstermek ve PTEN silinmesi gemms içinde tümörijenezde oranını artırır. Prostat organoidler mutant SPOPoverexpress için oluşturulan zaman, onların proliferasyonu kontrol prostat organoids ve lineage Marker ifade reapitulated orijinal prostat tümörlerine kıyasla arttı22. Bu çalışmalar birlikte, organoidlerin GEMMS 'de prostat tümörü özelliklerinin daha fazla çalışması için optimum bir model olduğunu göstermektedir.
Organoid kültürü de prostat tümör hücrelerinin bireysel alt nüfus değerlendirmek için bir araç olarak kullanılmıştır. Prostat epitelyal hücrelerinde PTEN ve PTEN ve Trp53 tümör bastırıcılar eksikliği gemm tümörleri kullanarak, ali ve ark. bazal ve luminal progensors içine fraksiyonel hücreler, bu alt nüfus organoids olarak yayıldı ve daha fazla kendi spesifik fenotürleri karakterize23. Böylece 3D hücre kültürü kullanarak, prostat tümörlerinin kendilerini içinde bolluk sınırlı olabilir tümör hücrelerinin alt nüfus karakterize etmek mümkündür.
Yukarıda açıklandığı gibi, 3D hücre kültürü teknikleri normal epitelyal hücrelerin büyümesini izin verir. Böylece, bir CRE sürücüsü bulunmayan GEMMs 'den üretilen prostat organoidleri, CRE Rekombinaz in vitro indüksiyon ile tümörün gerçek zamanlı izlenmesi için benzersiz bir model sağlar. Gerçekten de, Dardenne ve ark. nmyc ekspresyonu 'ın, ERT2-CRE ' d e ve tamoksifen21ile tedavi ederek zaman içinde PTEN kaybı bağlamında büyüme potansiyelini nasıl etkilediğini değerlendirdi. Ayrıca, prostat kanseri için tedavinin ana hedefi olan androjen reseptör (ar) üzerinde nmyc ekspresyonu etkisi, gemms21oluşturulan organoids CRE Rekombinaz indüksiyon sonra değerlendirildi. Aynı indüklenebilir CRE sistemi tarafından kullanıldı Blattner ve ark. prostat organoidler nasıl aşırı ifade mutant SPOP prostat kanseri hücre proliferasyon ve Ar ifade22etkiler ölçmek için. Özellikle, CRE ifadesi içinde vitro inducing deneyler araç-tedavi organoids ile yerleşik bir kanser olmayan kontrol var.
Prostat kanseri araştırmalarında 3D hücre kültürünü kullanmanın spesifik sınırlamaları
Normal epitelyal hücrelerin nevuslardır büyüme 3D hücre kültürü teknikleri kullanmanın bir avantajı iken, normal organoidler büyümek için kapasite de prostat kanseri araştırma çalışmalarında bir zorluk sundu. Temsili sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, daha az agresif prostat tümörlerden üretilen hatlarda normal prostat organoidlerin büyüme gözlemledik (Şekil 5). Bu fenomen adres için bir yol GEMMs bir CRE muhabir transgene, MT/mggibi ifade organoids oluşturmak için. Floresan mikroskopisi, domates ve GFP ifadesini gözlemleyerek tümör organoidlere normal bağıl oranını değerlendirmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, Gfp ifadesi saf prostat tümörü nevuslardır hatları oluşturmak için sıralama nevuslardır hücreleri akış için kullanılabilir. Alıcı ve ark. bir CRE muhabiri olmadan GEMM prostat tümörlerden normal epitelyal hücrelerin ve kanser hücrelerinin ayrılması için bir sıralama yöntemi gösterir. Onlar epitelyal hücre yapışması moleküler gösterir (EpCAM)-prostat tümörlerden pozitif hücreler, CD24 veya SCA-1 hücre yüzey işaretçileri23 kullanılarak sıralanmış alt nüfus içine ayrı değildi-böylece, bu işaretçileri normal dışlamak için istihdam edilebilir nevuslardır nesil önce gemm prostat tümörlerden prostat epitelyal hücreler. Bizim laboratuar ve diğerleri hangi altında prostat kanseri hücrelerinin organoidler formu ya da seçmek için ya da prostat bazal epitelyal hücrelerin karakteristik soy spesifik gen ifade programları teşvik görünür olduğunu gözlemledik. Bu önemli bir sorundur, çünkü hem fareler hem de insanlarda prostat tümörleri öncelikle doğada Luminal, AR, CK8 ve diğer luminal işaretçileri ifade ediyor ve nadiren P63 veya CK5 gibi bazal sırtı işaretçileri ifade. Bu fenomen henüz ayrıntılı olarak yayınlanmasına rağmen, immunhistokimya analizi, PTEN f/+ Ayrıca birlikte prostat21' e kıyasla PTENf/+ organoidlerde ar 'ın azaldığını gösterir. Prostat kanseri organoidlerde bazal epitelyal hücrelerin gelişimi, bu satırların gerçekten prostat kanserinin doğru bir ön-klinik modeli olup olmadığını sorgulamaya çağırır.
Prostat kanseri organoidleri, geleneksel 2D kültürden daha iyi türetildiği tümörü modellemek için belgelenmiş olmakla beraber, özellikle çeşitli pasajlardan sonra, kültürde genetik değişimler geçirmek için organoidlerin potansiyeli vardır. Şu anda, spontan genetik mutasyonlar, genetik kazançlar veya kayıplar veya prostat kanseri organoidlerinin uzun süreli geçişte sonra yaygın epigenetik değişiklikler belgelenmiş herhangi bir yayınlanmış çalışmaların farkında değiliz. Uzun süreli geçiş nedeniyle oluşabilecek genetik veya epigenetik değişiklikler sonucunda değişkenliği sınırlamak için, deneyler erken geçitlerden (< 10) mümkün olduğunca sık erken organoidlerde yapılmalıdır.
3D hücre kültürünün gelecekteki uygulamaları
Bu kanser araştırma 3D hücre kültürü kullanılarak geliştirilen tüm gelecekteki uygulamaları tahmin etmek imkansız olmakla beraber, en potansiyeline sahip görünen birkaç caddeleri vardır. 2D hücre hatlarında olduğu gibi, in vitro genetik modifikasyon yürütülmesi organoidlerde nispeten basittir. Normal veya kanserli organoidlerde belirli genler değiştirmek, özellikle genetik olarak değiştirilmiş organoidlerin nevuslardır oluşturmak için kullanıldığı zaman, tümör, kanser ilerlemesi ve tedavisi yöneten mekanizmaların çalışmada birçok olasılık açar ksenogreft. Organoidlerin genetik modifikasyon GEMMs belirli bir gen için yoksa veya yeni bir GEMM kurulması belirli bir çalışmanın kapsamı dışında olduğu zaman büyük ölçüde avantajlıdır.
Kanser nevuslardır kültürü de klinik araştırmalar için birçok potansiyel uygulamalara sahiptir. Her organ sistemi içinde her iki hastada ve hayvan modelindeki ilgili tümör alt türlerinin bir kütüphanesi, yeni bir ilacın etkinliğini veya mevcut ilaçların yeni kombinasyonunu hızla değerlendirmek için kullanılabilir. 3D hücre kültürü mainstream hale gelir ve verimlilikte artar, kişiselleştirilmiş tıbbın amacı için hasta türeyen organoidler üreten tüm mevcut ilaçlar ve kombinasyonları test ederek her kanser hastası için terzi tedavi yardımcı potansiyeli vardır kendi bireysel nevuslardır hattı kullanarak ilaçlar16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarları ifşa etmek için mali ilişkiler yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Stanford Üniversitesi 'ndeki Calvin Kuo Laboratuvarı 'na, HA-Mouse noggin-FC ya da HA-Mouse Rspo1-FC ile HEK293 hücrelerin stabil bir şekilde transfükresini sağlamak için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Dr. Dean Tang 'a laboratuvarında floresan Diseksiyon mikroskobu erişmemize izin verdiği için teşekkür etmek istiyoruz. Bu iş Ulusal Kanser Enstitüsü CA179907 tarafından D.W.G. tarafından destekleniyordu. Roswell Park kapsamlı Kanser Merkezi 'nde paylaşılan kaynaklar sağlık kanser merkezi destek Grant CA016056 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
