Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

Summary

De karakterisering van circulerende tumorcellen (Ctc’s) is een populair onderwerp in translationeel onderzoek. Dit protocol beschrijft een semiautomatische immunofluorescentie (IF)-test voor PD-L1-karakterisering en inventarisatie van Ctc’s in niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-patiënt monsters.

Abstract

Circulerende tumorcellen (Ctc’s) afgeleid van de primaire tumor worden vergoten in de bloedbaan of lymfatisch systeem. Deze zeldzame cellen (1 − 10 cellen per mL bloed) rechtvaardigen een slechte prognose en zijn gecorreleerd met een kortere totale overleving in verschillende kankers (bijv. borst, prostaat en colorectale). Momenteel is het met anti-EpCAM gecoate, op magnetische kraal gebaseerde CTC-opnamesysteem de gouden standaard test die is goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor het inventariseren van Ctc’s in de bloedbaan. Deze test is gebaseerd op het gebruik van magnetische kralen bekleed met anti-EpCAM markers, die specifiek gericht zijn op epitheliale kankercellen. Veel studies hebben aangetoond dat EpCAM niet de optimale marker is voor CTC-detectie. Inderdaad, Ctc’s zijn een heterogene subpopulatie van kankercellen en kunnen een epitheliale-naar-mesenchymale overgang ondergaan (EMT) in verband met gemetastaseerde proliferatie en invasie. Deze Ctc’s zijn in staat om de expressie van celoppervlak epitheliale marker EpCAM verminderen, terwijl het verhogen van mesenchymale markers zoals vimentin. Om deze technische hindernis aan te pakken, zijn er andere isolatie methoden ontwikkeld op basis van fysische eigenschappen van Ctc’s. Microfluïdische technologieën maken een etiket vrije benadering van CTC-verrijking van volledige bloedmonsters mogelijk. De spiraalvormige microfluïdische technologie maakt gebruik van de inertiële en Dean Sleep krachten met continue stroming in gebogen kanalen gegenereerd binnen een spiraal microfluïdische chip. De cellen worden gescheiden op basis van de verschillen in grootte en plasticiteit tussen normale bloedcellen en tumorale cellen. Dit protocol Details de verschillende stappen om de geprogrammeerde Death-ligand 1 (PD-L1) expressie van CTCs te karakteriseren, waarbij een spiraal microfluïdisch apparaat wordt gecombineerd met aanpasbare immunofluorescentie (IF) marker set.

Introduction

Tumor antigen-specifieke cytotoxische T-lymfocyten (Ctl’s) spelen een cruciale rol in de reactie op kanker door middel van een proces dat bekend staat als kanker “immuun surveillance”. Hun anti-tumor functies worden versterkt door immuun Checkpoint blokkade antilichamen zoals CTLA-4 remmers en PD-1/PD-L1-remmers. Bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) resulteren anti-PD-1/PD-L1 therapieën in responspercentages variërend van 0%-17% bij patiënten met PD-L1-negatieve tumoren en 36%-100% in degenen die PD-L1 uitdrukken. De robuuste responsen op PD-1/PD-L1-blokkade waargenomen bij melanoom en NSCLC worden aangetoond door het bewijs van een verbeterde algehele responsratio (RR), duurzame klinische voordelen en progressievrije overleving (PFS). Momenteel zijn anti-PD1 behandelingen de standaard van de zorg in de tweede-lijn NSCLC behandeling met nivolumab ongeacht PD-L1 expressie en met pembrolizumab bij patiënten die PD-L1 ≥ 1% uitdrukken. In de eerstelijnsbehandeling is de standaard van de zorg pembrolizumab alleen bij patiënten met nsclc die pd-L1 ≥ 50% uitdrukken en kunnen worden verhoogd met chemotherapie (Platin en Doublet medicijn afhankelijk van het histologische subtype)^1,2.

Echter, een dergelijke benadering van het beheer van de patiënt is discable³, aangezien PD-L1 expressie in tumorcellen door immunohistochemie (IHC) is waarschijnlijk niet de meest ideale metgezel biomarker. Anderen zoals tumor mutatie last⁴ (TMB), microsatellietinstabiliteit (MSI) en/of microbiota zijn mogelijk interessant in deze setting, alleen of in combinatie. NSCLC staat bekend als heterogene tumoren, ofwel ruimtelijk (van een tumor site naar een andere) of tijdelijk (van diagnose tot herhaling). Patiënten met NSCLC zijn meestal kwetsbaar, en iteratieve invasieve weefsel biopsieën kunnen een probleem zijn. Inderdaad, re-biopsie tarief bij eerste progressie varieert van 46%-84% afhankelijk van de reeks, en succesvolle re-biopsie (betekenis met histologische en volledige moleculaire analyse) varieert van 33%-75%. Dit betekent dat 25%-67% van de patiënten geen uitgebreide re-biopsie-analyse kan ontvangen tijdens de eerste progressie^5,6,7,8.

De komst van “Liquid biopsies” heeft dus veel enthousiasme gegenereerd in deze specifieke setting, omdat het cruciale herbeoordeling van moleculaire veranderingen tijdens ziekteprogressie mogelijk maakt door het onderzoeken van Circulerend vrij DNA (cfDNA) afgeleid van circulerende tumorcellen (Ctc’s). Deze levende cellen worden vrijgelaten uit de tumor in de bloedbaan, waar ze vrij circuleren. Hoewel niet routinematig gebruikt, lijkt de analyse van Ctc’s veelbelovend te zijn in het geval van moleculaire en fenotypische karakterisering, prognose en voorspellende betekenis bij longkanker (via Dnaseq, Rnaseq, Mirna en eiwitanalyse). Inderdaad, Ctc’s haven waarschijnlijk fenotypische kenmerken van de actieve ziekte in plaats van de initiële markers (gedetecteerd op weefsel biopsieën bij de diagnose). Bovendien, Ctc’s omzeilen het probleem van de ruimtelijke heterogeniteit van het tumorweefsel, die een cruciale kwestie in kleine biopsieën kan zijn. Bijgevolg kan PD-L1-expressie op Ctc’s mogelijk licht werpen op de verschillen die voortvloeien uit het gebruik ervan als een voorspellende biomarker met behulp van tumorweefsel.

Onlangs is PD-L1 Expression getest in Ctc’s van NSCLC. Bijna alle geteste patiënten⁹ waren PD-L1 positief, compliceren de interpretatie van het resultaat en het klinisch gebruik ervan. In totaal werden PD-L1-positieve Ctc’s gedetecteerd in 69,4% van de monsters van gemiddeld 4,5 cellen/mL¹⁰. Na aanvang van de radiotherapie nam het aandeel PD-L1-positieve Ctc’s significant toe, wat duidt op de upregulatie van PD-L1-expressie in reactie op straling¹¹. Daarom kan PD-L1 CTCs-analyse worden gebruikt om dynamische veranderingen van de tumor en de immuunrespons te monitoren, die de respons op chemotherapie, straling en waarschijnlijke immunotherapie (IT)-behandelingen kunnen weerspiegelen.

Tot op heden zijn de ctcs-isolatie en de PD-L1-karakterisering afhankelijk van verschillende methoden, zoals anti-epcam gecoate, op magnetische kraal gebaseerde CTC-vastlegging, verrijkings vrije analyse en op maat gebaseerde^12,13 CTC-opname testen. Ctc’s werden echter alleen gedetecteerd bij 45%-65% van de patiënten met gemetastaseerde NSCLC, waardoor hun vermogen om informatie te verstrekken voor meer dan de helft van gemetastaseerde NSCLC-patiënten werd beperkt. Bovendien was de CTC-telling laag in de meeste van deze onderzoeken met behulp van op grootte gebaseerde benadering¹⁰. Bovendien, deze methode heeft geleid tot discrepanties zoals de detectie van CD45 (-)/DAPI (+) cellen met “cytomorphological patronen van maligniteit” in de bloedbaan van gezonde donoren. Deze zorgen wijzen op de noodzaak van een zeer gevoelige methode van CTC-verzameling in verband met immuun-fenotyping van atypische CD45 (-) cellen van gezond volbloed met behulp van extra kanker biomarkers (d.w.z. TTF1, Vimentin, EpCAM en CD44) in NSCLC.

Daarom evalueerden we een spiraal microfluïdisch apparaat dat inertiële en Dean Sleep krachten gebruikt om cellen te scheiden op basis van grootte en plasticiteit door middel van een microfluïdische chip. De vorming van Dean Vortex stroomt in de microfluïdische chip resulteert in grotere Ctc’s gelegen langs de binnenwand en kleinere immuuncellen langs de buitenste wand van de chip. Het verrijkingsproces wordt voltooid door de grotere cellen in de opvang uitlaat te sibellen als de verrijkte CTC-Fractie. Deze methode is bijzonder gevoelig en specifiek (detectie van ongeveer 1 CTC/mL volbloed)¹⁴ en kan worden geassocieerd met aangepaste immunofluorescentie (if) analyses. Deze instrumenten zullen het opzetten van een positieve drempel voor klinische interpretatie mogelijk maken. Zo wordt een workflow beschreven die biologen in staat stelt om ctc’s met een hoge mate van terugwinning en specificiteit te isoleren en aspecten. Het protocol beschrijft het optimale gebruik van het spiraal microfluïdische apparaat om Ctc’s te verzamelen, de geoptimaliseerde IF-testen die kunnen worden aangepast aan het type kanker, en het gebruik van gratis open-source software voor het meten en analyseren van celafbeeldingen om een semi-automatische de numatie van de cellen volgens fluorescerende kleuring. Bovendien kan multiplexen van de Microscoop worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal beschikbare fluorescerende filters/markers.

Protocol

Monsters werden prospectief verzameld in het kader van de CIRCAN (“circulerende kanker”) cohort in het universitair ziekenhuis van Lyon na schriftelijke toestemming van de patiënt. Deze studie werd geïntegreerd in de CIRCAN_ALL cohort. De studie CIRCAN_ALL werd erkend als niet-Interventioneel door de CPP Zuid-Oost IV gedateerd 04/11/2015 onder de referentie L15-188. Een gewijzigde versie werd erkend als niet-Interventioneel op 20/09/2016 onder referentie L16-160. De CIRCAN_ALL studie werd verklaard aan de correspondent…

Representative Results

De eerste vereiste was om ongecontamineerde (infectieuze agent-Free) collecties van Ctc’s voor weefselkweek te verkrijgen en te voorkomen dat de achtergrond wordt gegenereerd. Het decontaminatie protocol zorgde voor reiniging van alle leidingen en pompen, en resulteerde in de verzameling van Ctc’s met een goede herstelsnelheid zonder bacteriële besmetting. De verrijkte monsters werden vergeleken zonder en met de decontaminatieprotocol-workflow van het spiraalvormige microfluïdische apparaat. Om het decontaminatie proto…

Discussion

Twee belangrijke punten zijn in de huidige studie aan de orde gesteld, de eerste met betrekking tot de prestaties van de workflow voor de overdracht ervan naar klinische toepassingen, en de tweede over de afname van subjectiviteit voor de analyse van de verkregen fluorescentie beelden.

Een performante en geoptimaliseerde workflow voor CTC-inventarisatie werd aanvankelijk bepaald met aanpasbare IF-assay na celverrijking via een CTC-label vrij microfluïdisch systeem (spiraal microfluïdisch app…

Materials

4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4°C
BD Facs Clean – 5L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4°C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4°C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4°C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4°C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4°C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone – 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4°C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4°C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4°C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4°C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4°C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4°C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4°C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software