Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza
Summary
La caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) è un argomento popolare nella ricerca traslazionale. Questo protocollo descrive un test di immunofluorescenza semi-automatica (IF) per la caratterizzazione PD-L1 e l’enumerazione dei CTC in campioni di pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC).
Abstract
Le cellule tumorali circolanti (CTC) derivate dal tumore primario vengono versate nel flusso sanguigno o nel sistema linfatico. Queste cellule rare (1,10 cellule per mL di sangue) giustificano una prognosi infamabile e sono correlate con una sopravvivenza complessiva più breve in diversi tipi di cancro (ad esempio, seno, prostata e colorettale). Attualmente, il sistema di cattura CTC basato su perline magnetico anti-EpCAM è il test standard d’oro approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per enumerare i CTC nel flusso sanguigno. Questo test si basa sull’uso di perline magnetiche rivestite con marcatori anti-EpCAM, che colpiscono specificamente le cellule tumorali epiteliali. Molti studi hanno dimostrato che epCAM non è il marcatore ottimale per il rilevamento CTC. Infatti, i CTC sono una sottopopolazione eterogenea di cellule tumorali e sono in grado di subire una transizione epiteliale-mesenferica (EMT) associata alla proliferazione metastatica e all’invasione. Questi CTC sono in grado di ridurre l’espressione del marcatore epiteliale della superficie cellulare EpCAM, aumentando al contempo marcatori mesenchymici come la vimentina. Per affrontare questo ostacolo tecnico, sono stati sviluppati altri metodi di isolamento basati sulle proprietà fisiche dei CTC. Le tecnologie microfluidiche consentono un approccio privo di etichette all’arricchimento del CTC da campioni di sangue intero. La tecnologia microfluidica a spirale utilizza le forze di trascinamento inerziali e Decano con flusso continuo in canali curvi generati all’interno di un chip microfluidico a spirale. Le cellule sono separate in base alle differenze di dimensioni e plasticità tra le cellule del sangue normali e le cellule tumorali. Questo protocollo descrive in dettaglio i diversi passaggi per caratterizzare l’espressione programmata death-ligand 1 (PD-L1) dei CTC, combinando un dispositivo microfluidico a spirale con set di marcatori immunofluorescenza (IF) personalizzabili.
Introduction
I TL (TL) specifici dell’antigene tumorale svolgono un ruolo cruciale nella risposta ai tumori attraverso un processo noto come “sorveglianza immunitaria” del cancro. Le loro funzioni antitumorali sono potenziate da anticorpi di blocco del checkpoint immunitario come gli inibitori ctLA-4 e gli inibitori PD-1/PD-L1. Nel cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC), le terapie anti-PD-1/PD-L1 si traducono in tassi di risposta che vanno dallo 0%-17% nei pazienti con tumori PD-L1-negativi e 36%-100% in quelli che esprimono PD-L1. Le risposte robuste al blocco PD-1/PD-L1 osservate nel melanoma e nel NSCLC sono mostrate da prove di un miglioramento del tasso di risposta globale (RR), dei benefici clinici duraturi e della sopravvivenza senza progressione (PFS). Attualmente, i trattamenti anti-PD1 sono lo standard di cura nel trattamento NSCLC di seconda linea con nivolumab indipendentemente dall’espressione PD-L1 e con pembrolizumab in pazienti che esprimono PD-L1 1%. Nel trattamento di prima linea, standard di cura è pembrolizumab da solo in pazienti con NSCLC che esprimono PD-L1 -50% e può essere potenzialmente migliorato con la chemioterapia (platin e doublet drug a seconda del sottotipo istologico)1,2.
Tuttavia, un tale approccio alla gestione del paziente è discutibile3, poiché l’espressione PD-L1 nelle cellule tumorali per immunohistochimica (IHC) probabilmente non è il biomarcatore compagno più ideale. Altri come il carico di mutazione tumorale4 (TMB), l’instabilità dei microsatelliti (MSI) e/o il microbiota sono probabilmente interessanti in questo ambiente da soli o in combinazione. NSCLC sono noti per essere tumori eterogenei, sia spazialmente (da un sito tumorale a un altro) o temporalmente (dalla diagnosi alla ricorrenza). I pazienti con NSCLC sono solitamente fragili e le biopsie iterative dei tessuti possono essere un problema. Infatti, il tasso di ri-biopsia alla prima progressione varia dal 46%-84% a seconda della serie, e la ri-biopsia di successo (che significa con analisi molecolare istologica e completa) varia dal 33%-75%. Ciò significa che il 25%-67% dei pazienti non può ricevere un’analisi di ribio completa durante la prima progressione5,6,7,8.
L’avvento delle “biopsie liquide” ha quindi generato un notevole entusiasmo in questo particolare contesto, in quanto consente una rivalutazione cruciale delle alterazioni molecolari durante la progressione della malattia esaminando il DNA libero circolante (cfDNA) derivato dalla circolazione cellule tumorali (CTC). Queste cellule vive vengono rilasciate dal tumore nel flusso sanguigno, dove circolano liberamente. Sebbene non venga utilizzata regolarmente, l’analisi dei CTC sembra essere molto promettente nel caso della caratterizzazione molecolare e fenotipica, della prognosi e del significato predittivo nel cancro del polmone(tramite DNAseq, RNAseq, miRNA e analisi delle proteine). Infatti, le CTC probabilmente ospitano caratteristiche fenotipiche della malattia attiva piuttosto che i marcatori iniziali (rilevati sulle biopsie dei tessuti alla diagnosi). Inoltre, i CTC bypassano il problema dell’eterogeneità spaziale del tessuto tumorale, che può essere un problema cruciale nelle piccole biopsie. Di conseguenza, l’espressione PD-L1 sui CTC può potenzialmente far luce sulle discrepanze derivate dal suo uso come biomarcatore predittivo utilizzando il tessuto tumorale.
Recentemente, l’espressione PD-L1 è stata testata nei CTC di NSCLC. Quasi tutti i pazienti testati9 erano PD-L1 positivo, complicando l’interpretazione del risultato e il suo uso clinico. Complessivamente, sono stati rilevati CTC PD-L1 positivi nel 69,4% dei campioni da una media di 4,5 cellule/mL10. Dopo l’inizio della radioterapia, la percentuale di CTC PD-L1-positivi è aumentata in modo significativo, indicando l’upregolazione dell’espressione PD-L1 in risposta alle radiazioni11. Di conseguenza, l’analisi dei CTC PD-L1 può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti dinamici del tumore e della risposta immunitaria, che possono riflettere la risposta alla chemioterapia, alle radiazioni e ai probabili trattamenti di immunoterapia (IT).
Ad oggi, l’isolamento CTCs e la caratterizzazione PD-L1 si basano su vari metodi come l’acquisizione CTC basatasu perline magnetiche anti-EpCAM, l’analisi basata sull’arricchimento e i saggi di acquisizione 12,13 CTC basati sulle dimensioni. Tuttavia, le CTC sono state rilevate solo nel 45%-65% dei pazienti con NSCLC metastatico, limitando così la loro capacità di fornire informazioni per più della metà dei pazienti con NSCLC metastatico. Inoltre, il numero di CTC era basso nella maggior parte di questi studi utilizzando l’approccio basato sulle dimensioni10. Inoltre, questo metodo ha portato a discrepanze come la rilevazione di cellule CD45(-)/DAPI() con “modelli citomorfologici di malignità” nel flusso sanguigno di donatori sani. Queste preoccupazioni evidenziano la necessità di un metodo altamente sensibile di raccolta CTC associato con immuno-fenotyping di cellule atipiche CD45 (-) da sangue intero sano utilizzando ulteriori biomarcatori del cancro (cioè, TTF1, Vimentin, EpCAM, e CD44) in NSCLC.
Di conseguenza, abbiamo valutato un dispositivo microfluidico a spirale che utilizza forze di trascinamento inerziali e Decano per separare le cellule in base alle dimensioni e alla plasticità attraverso un chip microfluidico. La formazione del vortice Dean scorre presente nel chip microfluidico si traduce in CTC più grandi situati lungo la parete interna e cellule immunitarie più piccole lungo la parete esterna del chip. Il processo di arricchimento si completa sifonando le cellule più grandi nella presa di raccolta come frazione CTC arricchita. Questo metodo è particolarmente sensibile e specifico (rilevamento di circa 1 CTC/mL di sangue intero)14 e può essere associato ad analisi di immunofluorescenza personalizzate (IF). Questi strumenti consentiranno di stabilire una soglia positiva per l’interpretazione clinica. Viene quindi descritto un flusso di lavoro che consente ai biologi di isolare e i CTC immunofenotipi con un alto tasso di recupero e specificità. Il protocollo descrive l’uso ottimale del dispositivo microfluidico a spirale per raccogliere CTC, i saggi IF ottimizzati che possono essere personalizzati in base al tipo di cancro e l’uso di software open source gratuito per la misurazione e l’analisi delle immagini cellulari per eseguire un numerazione delle cellule in base alla colorazione fluorescente. Inoltre, il multiplexing al microscopio può essere effettuato a seconda del numero di filtri/marcatori fluorescenti disponibili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel presente studio sono stati sollevati due punti principali, il primo per quanto riguarda l’esecuzione del flusso di lavoro per il suo trasferimento ad applicazioni cliniche e il secondo relativo alla diminuzione della soggettività per l’analisi delle immagini a fluorescenza ottenute.
Un flusso di lavoro performante e ottimizzato per l’enumerazione CTC è stato inizialmente determinato utilizzando un saggio IF personalizzabile dopo l’arricchimento delle celle tramite un sistema microfluidic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni per la ricerca di Astra-eneca (Londra, Regno Unito), Biolidics (Singapore) e della Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, Francia). Gli autori ringraziano le aziende di Astra-eneca e Biolidics per il loro sostegno finanziario.
Materials
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
| BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
Referências
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