免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙
Summary
循環腫瘍細胞(CTC)の特徴付けは、翻訳研究で一般的な話題です。このプロトコルは、非小細胞肺癌(NSCLC)患者サンプルにおけるCTCのPD-L1特性測定および列挙に関する半自動免疫蛍光(IF)アッセイについて説明する。
Abstract
原発性腫瘍に由来する循環腫瘍細胞(CTC)は、血流またはリンパ系に流れ込む。これらの希少細胞(血液のmL当たり1−10細胞)は予後不良を保証し、いくつかの癌(例えば、乳房、前立腺および結腸直腸)の全体的な生存率の短さと相関する。現在、抗EpCAMコーティング磁気ビーズベースのCTC捕捉システムは、血流中のCTCを列挙するための米国食品医薬品局(FDA)によって承認されたゴールドスタンダードテストです。この試験は、特に上皮癌細胞を標的とする抗EpCAMマーカーでコーティングされた磁気ビーズの使用に基づいています。多くの研究は、EpCAMがCTC検出に最適なマーカーではないことを示しています。実際、CTCは癌細胞の不均一な亜集団であり、転移増殖および侵入に関連する上皮間葉転移(EMT)を受けることができる。これらのCTCは、細胞表面上皮マーカーEpCAMの発現を減少させ、ビメンチンなどの間葉系マーカーを増加させることができる。この技術的なハードルに対処するため、CTCの物理的特性に基づく他の分離方法が開発されている。マイクロ流体技術は、全血サンプルからのCTC濃縮に対するラベルフリーのアプローチを可能にします。スパイラルマイクロ流体技術は、スパイラルマイクロ流体チップ内で生成された曲面チャネル内の連続的な流れを持つ慣性およびディーンドラッグ力を使用します。細胞は、正常な血液細胞と腫瘍細胞の間の大きさと可塑性の違いに基づいて分離されます。このプロトコルは、プログラムされた死リガンド1(PD-L1)CTC発現を特徴付けるさまざまなステップを詳細に説明し、スパイラルマイクロ流体デバイスとカスタマイズ可能な免疫蛍光(IF)マーカーセットを組み合わせる。
Introduction
腫瘍抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、がん「免疫監視」と呼ばれるプロセスを通じて癌への応答に重要な役割を果たします。それらの抗腫瘍機能は、CTLA-4阻害剤およびPD-1/PD-L1阻害剤などの免疫チェックポイント遮断抗体によって増強される。非小細胞肺癌(NSCLC)では、抗PD-1/PD-L1療法は、PD-L1陰性腫瘍患者では0%~17%、PD-L1を発現する患者では36%~100%の応答率をもたらす。黒色腫およびNSCLCで観察されたPD-1/PD-L1遮断に対する強い応答は、全体的な応答率(RR)、耐久性のある臨床上の利点、および無増悪生存(PFS)の改善の証拠によって示される。現在、抗PD1治療は、PD-L1発現にかかわらずニボルマブを有する第2ラインNSCLC治療における治療の標準であり、PD-L1≥1%を発現する患者におけるペンブロリズマブを有する。第一線治療において、治療の標準は、PD-L1≥50%を発現するNSCLC患者において単独でペンブロリズマブであり、化学療法(組織学的サブタイプに応じてプラチンおよび二重薬物)1、2で潜在的に増強することができる。
しかしながら、このような患者管理へのアプローチは議論の余地がある3は、免疫組織化学(IHC)による腫瘍細胞におけるPD-L1発現は、おそらく最も理想的なコンパニオンバイオマーカーではない。腫瘍突然変異負担4(TMB)、マイクロサテライト不安定性(MSI)、および/または微生物叢などの他のものは、単独または組み合わせのいずれかでこの設定において興味深い可能性があります。NSCLCは、空間的に(腫瘍部位から別の腫瘍部位へ)または一時的に(診断から再発まで)異種腫瘍であることが知られている。NSCLCの患者は通常壊れやすく、反復的な侵襲的組織生検が問題になる可能性があります。実際、最初の進行時の再生検率は、系列に応じて46%から84%の範囲であり、成功した再生検(組織学的および完全な分子分析を伴う意味)は33%から75%の範囲である。これは、患者の25%-67%が最初の進行5、6、7、8の間に包括的な再生検分析を受けることができないことを意味する。
「液体生検」の出現は、循環由来の循環性DNA(cfDNA)を調べることにより、疾患進行時の分子変化の重要な再評価を可能にするため、この特定の設定でかなりの熱意を生み出しました。腫瘍細胞(CTC)。これらの生細胞は腫瘍から血流に放出され、そこで自由に循環する。CTCの分析は日常的に使用されていないが、肺癌における分子的および表現型的特徴付け、予後、および予測的意義の場合(DNAseq、RNAseq、miRNAおよびタンパク質分析を介して)において非常に有望であると思われる。実際、CTCは初期マーカーではなく、活性疾患の型表示特性を持つ可能性が高い(診断時に組織生検で検出される)。さらに、CTCは腫瘍組織の空間的不均一性の問題をバイパスし、これは小さな生検において重要な問題でありうる。その結果、CTC上のPD-L1発現は、腫瘍組織を用いた予測バイオマーカーとしての使用に由来する不一致を明らかにする可能性がある。
近年、PD-L1発現はNSCLCのCTCで試験されている。9を検査した患者のほとんどはPD-L1陽性であり、結果とその臨床使用の解釈を複雑にした。全体として、PD-L1陽性CTCは、平均4.5セル/mL10からのサンプルの69.4%で検出された。放射線治療の開始後、PD-L1陽性CTCの割合が有意に増加し、放射線11に応答するPD-L1発現のアップレギュレーションを示した。したがって、PD-L1 CTC分析は、化学療法、放射線、および可能性の高い免疫療法(IT)治療に対する応答を反映する腫瘍および免疫応答の動的変化を監視するために使用することができる。
現在までに、CTCの分離およびPD-L1特性化は、抗EpCAMコーティング磁気ビーズベースのCTC捕捉、濃縮フリーベースのアッセイ、サイズベースの12、13 CTCキャプチャアッセイなどの様々な方法に依存しています。しかし、CTCは転移性NSCLC患者の45%~65%でのみ検出され、転移性NSCLC患者の半数以上に情報を提供する能力が制限されました。さらに、CTC数は、サイズベースのアプローチ10を使用して、これらの研究のほとんどで低かった。さらに、この方法は、健康なドナーの血流における「悪性腫瘍の細胞形態パターン」を有するCD45(-)/DAPI(+)細胞の検出などの不一致をもたらした。これらの懸念は、NSCLCにおける追加の癌バイオマーカー(すなわち、TTF1、ビメンチン、EpCAM、およびCD44)を用いて健康な全血からの非定型CD45(-)細胞の免疫表現型に関連するCTCコレクションの高感度な方法の必要性を強調している。
その結果、慣性とディーンドラッグ力を用いて、マイクロ流体チップを介してサイズと可塑性に基づいて細胞を分離するスパイラルマイクロ流体デバイスを評価しました。マイクロ流体チップに存在するディーン渦の形成は、内壁に沿って位置するより大きなCTCと、チップの外壁に沿ってより小さな免疫細胞をもたらす。濃縮プロセスは、濃縮CTC分画として、より大きな細胞を集出口にサイフォンすることによって完了する。この方法は、特に感受性および特異的(全血の約1 CTC/mLの検出)14であり、カスタマイズされた免疫蛍光(IF)分析に関連させることができる。これらの用具は臨床解釈のための肯定的なしきい値の設定を可能にする。このように、生物学者が高い回復率と特異性を持つ免疫表現型CTCを分離し、免疫性を高めるワークフローを説明します。このプロトコルは、CTCを収集するためのスパイラルマイクロ流体デバイスの最適な使用、癌の種類に応じてカスタマイズできる最適化されたIFアッセイ、および半自動を実行するために細胞画像を測定および分析するための無料のオープンソースソフトウェアの使用について説明します。蛍光染色による細胞の数値化。さらに、顕微鏡多重化は、利用可能な蛍光フィルター/マーカーの数に応じて行うことができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、臨床応用への移植ワークフローの性能に関する2つの大きなポイント、第1の点は、得られた蛍光画像の分析のための主観性の低下に関する2つである。
CTC列挙のための実行可能で最適化されたワークフローは、CTCラベルフリーマイクロ流体システム(スパイラルマイクロ流体デバイス)を介した細胞濃縮後のカスタマイズ可能なIFアッセイを用いて最初に決定さ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、アストラゼネカ(ロンドン、イギリス)、バイオリディックス(シンガポール)、リーグ・コントル・ル・ガン(フランス・ローレ)からの研究助成金によって支えられた。著者らは、アストラゼネカとバイオリディクスの企業の財政的支援に感謝している。
Materials
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
| BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
Referências
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