इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर रोगियों से अर्द्ध-स्वचालित पीडी-एल 1 विशेषता और परिसंचरण ट्यूमर कोशिकाओं की गणना
Summary
ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) घूम की विशेषता अनुवाद अनुसंधान में एक लोकप्रिय विषय है. इस प्रोटोकॉल पीडी-L1 विशेषता और गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) रोगी के नमूने में सीटीसी की गणना के लिए एक अर्द्ध स्वचालित इम्यूनोफ्लोरेसी (आईएफ) परख का वर्णन करता है।
Abstract
प्राथमिक ट्यूमर से व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) परिसंचरण खून या लसीका प्रणाली में बहा रहे हैं। इन दुर्लभ कोशिकाओं (1 “10 कोशिकाओं रक्त के प्रति एमएल) एक गरीब रोग का रोग का पूर्वानुमान वारंट और कई कैंसर में कम समग्र अस्तित्व के साथ सहसंबद्ध हैं (उदा., स्तन, प्रोस्टेट और कोलोरेक्टल). वर्तमान में, विरोधी EpCAM लेपित चुंबकीय मनका आधारित सीटीसी कब्जा प्रणाली खून में सीटीसी की गणना के लिए अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित सोने के मानक परीक्षण है. यह परीक्षण एंटी-एपकैम मार्कर के साथ लेपित चुंबकीय मोती के उपयोग पर आधारित है, जो विशेष रूप से उपकला कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करते हैं। कई अध्ययनों से स्पष्ट है कि EpCAM CTC का पता लगाने के लिए इष्टतम मार्कर नहीं है। दरअसल, सीटीसी कैंसर कोशिकाओं की एक विषम उपजनसंख्या हैं और मेटास्टैटिक प्रसार और आक्रमण के साथ जुड़े एक उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरने में सक्षम हैं। इन CTCs सेल सतह उपकला मार्कर EpCAM की अभिव्यक्ति को कम करने में सक्षम हैं, जबकि इस तरह के vimentin के रूप में mesenchymal मार्करों में वृद्धि. इस तकनीकी बाधा को दूर करने के लिए, सीटीसी के भौतिक गुणों पर आधारित अन्य अलगाव विधियां विकसित की गई हैं। Microfluidic प्रौद्योगिकियों पूरे रक्त के नमूनों से सीटीसी संवर्धन के लिए एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण सक्षम. सर्पिल microfluidic प्रौद्योगिकी एक सर्पिल microfluidic चिप के भीतर उत्पन्न घुमावदार चैनलों में निरंतर प्रवाह के साथ जड़त्वीय और डीन खींचें बलों का उपयोग करता है. कोशिकाओं को सामान्य रक्त कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच आकार और प्लास्टिक में अंतर के आधार पर अलग कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल का विवरण CTCs के क्रमादेशित मौत-लिगंड 1 (पीडी-L1) अभिव्यक्ति की विशेषता के लिए विभिन्न चरणों, अनुकूलन इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) मार्कर सेट के साथ एक सर्पिल microfluidic डिवाइस के संयोजन.
Introduction
ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट साइटोटॉक्सिक टी-लिम्फोसाइट (सीटीएल) कैंसर “प्रतिरक्षा निगरानी” के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से कैंसर की प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उनके विरोधी ट्यूमर कार्यों ऐसे CTLA-4 inhibitors और पीडी-1/PD-L1 inhibitors के रूप में प्रतिरक्षा जांच चौकी नाकाबंदी एंटीबॉडी द्वारा बढ़ाया जाता है। गैर-छोटी कोशिका फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) में, पीडी-1/पीडी-एल 1 उपचारों के परिणामस्वरूप पीडी-एल 1-नकारात्मक ट्यूमर वाले रोगियों में 0%-17% और पीडी-एल 1 व्यक्त करने वालों में 36%-100% से लेकर प्रतिक्रिया दरों में परिणाम होता है। पीडी-1/पीडी-एल 1 मेलेनोमा और NSCLC में मनाया नाकाबंदी के लिए मजबूत प्रतिक्रियाओं में सुधार समग्र प्रतिक्रिया दर (आरआर), टिकाऊ नैदानिक लाभ, और प्रगति मुक्त अस्तित्व (PFS) के सबूत द्वारा दिखाए जाते हैं. वर्तमान में, विरोधी PD1 उपचार PD-L1 अभिव्यक्ति की परवाह किए बिना और पीडी-L1 $ 1% व्यक्त रोगियों में pembrolizumab के साथ nivolumab के साथ दूसरी लाइन NSCLC उपचार में देखभाल के मानक हैं. पहली लाइन के उपचार में, देखभाल के मानक NSCLC के साथ रोगियों में अकेले pembrolizumab है पीडी-एल 1 $50% व्यक्त और संभावित रसायन चिकित्सा के साथ बढ़ाया जा सकता है (प्लेटिन और द्वि गुणिक दवा हिस्टोलॉजिक उपप्रकार के आधार पर)1,2.
हालांकि, रोगी प्रबंधन के लिए इस तरह के एक दृष्टिकोण विवादास्पद3है, के बाद से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति शायद सबसे आदर्श साथी biomarker नहीं है. ट्यूमर उत्परिवर्तन बोझ4 (TMB), microsatellite अस्थिरता (एमएसआई), और / या microbiota के रूप में दूसरों को संभवतः अकेले या संयोजन में इस सेटिंग में दिलचस्प हैं. NSCLC विषम ट्यूमर होने के लिए जाना जाता है, या तो स्थानिक (एक ट्यूमर साइट से एक दूसरे के लिए) या लौकिक (निदान से पुनरावृत्ति के लिए). NSCLC के साथ मरीजों को आम तौर पर नाजुक हैं, और आक्रामक इनवेसिव ऊतक बायोप्सी एक मुद्दा हो सकता है. दरअसल, पहली प्रगति पर फिर से बायोप्सी दर श्रृंखला के आधार पर 46%-84% से लेकर, और सफल फिर से बायोप्सी (हिस्टोलॉजिकल और पूर्ण आणविक विश्लेषण के साथ अर्थ) 33%-75% से पर्वतमाला. इसका मतलब यह है कि 25%-67% रोगियों को पहली प्रगति5,6,7,8के दौरान एक व्यापक पुन: बायोप्सी विश्लेषण प्राप्त नहीं कर सकते .
“तरल बायोप्सी” के आगमन इस प्रकार इस विशेष सेटिंग में काफी उत्साह उत्पन्न किया है, के रूप में यह रोग प्रगति के दौरान आणविक परिवर्तन के महत्वपूर्ण पुनर्मूल्यांकन में सक्षम बनाता है घूम मुक्त डीएनए (cfDNA) घूम से व्युत्पन्न की जांच करके ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी)। इन जीवित कोशिकाओं ट्यूमर से खून में जारी कर रहे हैं, जहां वे स्वतंत्र रूप से प्रसारित. हालांकि नियमित रूप से इस्तेमाल नहीं किया, CTCs के विश्लेषण के लिए आणविक और phenotypic लक्षण, पूर्वानुमान, और फेफड़ों के कैंसर में भविष्य कहनेवाला महत्व के मामले में अत्यधिक आशाजनक प्रतीत होता है (DNAseQ केमाध्यम से, RNAseQ, miRNA और प्रोटीन विश्लेषण). दरअसल, सीटीसी की संभावना प्रारंभिक मार्करों के बजाय सक्रिय रोग के phenotypic विशेषताओं बंदरगाह (निदान पर ऊतक बायोप्सी पर पता चला). इसके अलावा, सीटीसी ट्यूमर ऊतक के स्थानिक विषमता की समस्या को बाईपास करते हैं, जो छोटे बायोप्सी में एक महत्वपूर्ण मुद्दा हो सकता है। नतीजतन, सीटीसी पर पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति संभवतः ट्यूमर ऊतक का उपयोग कर एक भविष्य कहनेवाला biomarker के रूप में इसके उपयोग से प्राप्त विसंगतियों पर प्रकाश डाला जा सकता है.
हाल ही में, एनएससीएलसी के सीटीसी में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति का परीक्षण किया गया है। परीक्षणकिए गए लगभग सभी रोगी पीडी-एल 1 सकारात्मक थे, परिणाम की व्याख्या और इसके नैदानिक उपयोग को जटिल बना रहे थे। कुल मिलाकर, पीडी-एल 1 सकारात्मक सीटीसी 4.5 कोशिकाओं के एक औसत सेनमूने के 69.4% में पाया गया / विकिरण चिकित्सा की शुरुआत के बाद, पीडी-एल 1-सकारात्मक सीटीसी का अनुपात काफी बढ़ गया, जो विकिरण11के जवाब में पीडी-एल 1 अभिव्यक्ति के विनियमन का संकेत देता है। इसलिए, पीडी-एल 1 सीटीसी विश्लेषण का उपयोग ट्यूमर और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के गतिशील परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए किया जा सकता है, जो कीमोथेरेपी, विकिरण, और संभावित इम्यूनोथेरेपी (आईटी) उपचार की प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित कर सकता है।
तारीख करने के लिए, सीटीसी अलगाव और पीडी-L1 विशेषता इस तरह के विरोधी EpCAM लेपित चुंबकीय मनका आधारित सीटीसी पर कब्जा, संवर्धन मुक्त आधारित परख, और आकार आधारित12,13 सीटीसी कब्जा assays के रूप में विभिन्न तरीकों पर भरोसा करते हैं। तथापि, सीटीसी का केवल मेटास्टैटिक एनएससीएलसी वाले 45%-65% रोगियों में पाया गया, जिससे मेटास्टैटिक एनएससीएलसी के आधे से अधिक रोगियों के लिए कोई सूचना प्रदान करने की उनकी क्षमता सीमित हो गई। इसके अलावा, सीटीसी गिनती आकार आधारित दृष्टिकोण10का उपयोग कर इन अध्ययनों में से अधिकांश में कम था. इसके अलावा, इस विधि ने स्वस्थ दाताओं के खून में “द्रोह के cytomorphological पैटर्न” के साथ CD45(-)/DAPI(+) कोशिकाओं का पता लगाने जैसी विसंगतियों को बढ़ावा दिया है। इन चिंताओं को अतिरिक्त कैंसर biomarkers का उपयोग कर स्वस्थ पूरे रक्त से अटूट CD45 (-) कोशिकाओं की प्रतिरक्षा-phenotyping के साथ जुड़े सीटीसी संग्रह की एक अत्यधिक संवेदनशील विधि की आवश्यकता पर प्रकाश डाला (यानी, TTF1, Vimentin, EpCAM, और CD44) NSCLC में.
नतीजतन, हम एक सर्पिल microfluidic डिवाइस है कि जड़त्वका का उपयोग करता है और डीन खींचें बलों का मूल्यांकन करने के लिए एक microfluidic चिप के माध्यम से आकार और प्लास्टिक के आधार पर कोशिकाओं को अलग. डीन भंवर के गठन microfluidic चिप में मौजूद आंतरिक दीवार और चिप की बाहरी दीवार के साथ छोटे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ स्थित बड़ा सीटीसी में मौजूद बहती है. संवर्धन प्रक्रिया समृद्ध सीटीसी अंश के रूप में संग्रह आउटलेट में बड़े कोशिकाओं sphoning द्वारा पूरा किया है. यह विधि विशेष रूप से संवेदनशील और विशिष्ट है (पूरे रक्त के लगभग 1 सीटीसी/एमएल का पता लगाना)14 और अनुकूलित इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) विश्लेषण के साथ संबद्ध किया जा सकता है। इन उपकरणों नैदानिक व्याख्या के लिए एक सकारात्मक सीमा की स्थापना सक्षम हो जाएगा. एक कार्यप्रवाह इस प्रकार वर्णित है कि जीवविज्ञानियों को अलग करने और इम्यूनोफेनोटाइप CTCs वसूली और विशिष्टता की एक उच्च दर के साथ सक्षम बनाता है. प्रोटोकॉल CTCs इकट्ठा करने के लिए सर्पिल microfluidic डिवाइस के इष्टतम उपयोग का वर्णन करता है, अनुकूलित IF परख कि कैंसर के प्रकार के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है, और सेल छवियों को मापने और विश्लेषण के लिए मुक्त खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक अर्द्ध स्वचालित प्रदर्शन फ्लोरोसेंट धुंधला के अनुसार कोशिकाओं की संख्या. इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप बहुसंकेतन उपलब्ध फ्लोरोसेंट फिल्टर/मार्कर की संख्या के आधार पर किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
दो प्रमुख अंक वर्तमान अध्ययन में उठाए गए थे, पहले के साथ नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अपने हस्तांतरण के लिए कार्यप्रवाह के प्रदर्शन का संबंध है, और दूसरा प्राप्त फ्लोरोसेंट छवियों के विश्लेषण के लिए विष…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम Astraeca (लंदन, यूनाइटेड किंगडम), Biolidics (सिंगापुर) और लीग Contre ले कैंसर (सोन एट लॉयर, फ्रांस) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकअपने वित्तीय समर्थन के लिए एस्ट्राज़ेनेका और Biolidics कंपनियों का शुक्र है.
Materials
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
| BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
Referências
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