Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og opplisting av sirkulerende tumor celler fra ikke-liten celle Lungekreftpasienter ved Immunofluorescence

Summary

Karakterisering av sirkulerende tumorceller (CTC) er et populært tema i translational forskning. Denne protokollen beskriver en semi-automatisk immunofluorescence (IF)-analysen for PD-L1 karakterisering og opplisting av CTC i ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) pasientprøver.

Abstract

Sirkulerende tumorceller (CTC) avledet fra den primære svulsten er utgytt i blodet eller lymfesystemet. Disse sjeldne cellene (1 − 10 celler per mL blod) garanterer en dårlig prognose og er korrelert med kortere total overlevelse i flere kreftformer (f.eks. bryst, prostata og tykk). Foreløpig er anti-EpCAM-belagt magnetisk perle-baserte CTC fange systemet gullstandarden test godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for opplisting CTC i blodet. Denne testen er basert på bruk av magnetiske perler belagt med anti-EpCAM markører, som spesifikt mål epitel kreftceller. Mange studier har illustrert at EpCAM ikke er den optimale markør for CTC deteksjon. Faktisk, CTC er en heterogen pasientpopulasjonen av kreftceller og er i stand til å gjennomgå en epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) forbundet med metastatisk spredning og invasjon. Disse CTC er i stand til å redusere uttrykk for celle overflate epitel markør EpCAM, mens økende mesenchymal markører som vimentin. For å løse dette tekniske hinderet, har andre isolasjons metoder basert på fysiske egenskaper CTC blitt utviklet. Mikrovæskebasert teknologier muliggjør en etikett fri tilnærming til CTC-berikelse fra hele blodprøver. Spiral mikrovæskebasert teknologien bruker treghet og Dean drag krefter med kontinuerlig strømning i buede kanaler generert innenfor en spiral mikrovæskebasert chip. Cellene er separert basert på forskjellene i størrelse og plastisitet mellom normale blodceller og tumoral celler. Denne protokollen detaljer de ulike trinnene for å karakterisere den programmerte Death-ligand 1 (PD-L1) uttrykk for CTC, og kombinerer en spiral mikrovæskebasert enhet med passelig immunofluorescence (IF) markør sett.

Introduction

Tumor antigen-spesifikke cytotoksisk T-lymfocytter (CTLer) spiller en avgjørende rolle i responsen til kreft gjennom en prosess som kalles kreft “immun overvåking”. Deres anti-tumor funksjoner forsterkes av immun kontrollpunkt blokade antistoffer som CTLA-4 hemmere og PD-1/PD-L1-hemmere. I ikke-liten celle lungekreft (NSCLC), anti-PD-1/PD-L1 terapier resultere i responsrater som spenner fra 0%-17% hos pasienter med PD-L1-negative svulster og 36%-100% i de uttrykker PD-L1. Den robuste responsen til PD-1/PD-L1-blokaden observert i melanom og NSCLC er vist ved tegn på bedret totalrespons rate (RR), holdbare kliniske fordeler, og progresjonsfri overlevelse (PFS). For tiden er anti-PD1 behandlinger standarden for behandling i andre linje NSCLC behandling med nivolumab uavhengig av PD-L1-uttrykk og med pembrolizumab hos pasienter som uttrykker PD-L1 ≥ 1%. I første-linje behandling er standard for pleie pembrolizumab alene hos pasienter med NSCLC som uttrykker PD-L1 ≥ 50% og kan potensielt forbedres med kjemoterapi (Platin og doublet legemiddel avhengig av histologic under type)^1,2.

Imidlertid er en slik tilnærming til pasientbehandling diskuteres³, siden PD-L1 uttrykk i tumorceller ved IMMUNHISTOKJEMI (IHC) er trolig ikke den mest ideelle følgesvenn biomarkør. Andre som tumor mutasjon byrde⁴ (TMB), mikrosatellittmarkør ustabilitet (MSI), og/eller bakterieflora er muligens interessant i denne innstillingen enten alene eller i kombinasjon. NSCLC er kjent for å være heterogene svulster, enten romlig (fra en svulst området til en annen) eller timelig (fra diagnose til gjentakelse). Pasienter med NSCLC er vanligvis skjøre, og repeterende invasiv vev biopsier kan være et problem. Faktisk, re-biopsi rate ved første progresjon varierer fra 46%-84% avhengig av serien, og vellykket re-biopsi (som betyr med histologiske og full molekylær analyse) spenner fra 33%-75%. Dette betyr at 25%-67% av pasientene ikke kan motta en omfattende re-biopsi analyse under første progresjon^5,6,7,8.

Ankomsten av “flytende biopsier” har dermed generert betydelig entusiasme i denne spesielle innstillingen, da det muliggjør avgjørende revurdering av molekylær endringer under sykdomsprogresjon ved å undersøke sirkulerende gratis DNA (cfDNA) avledet fra sirkulerende tumorceller (CTC). Disse levende celler frigjøres fra svulsten inn i blodet, der de sirkulerer fritt. Selv om det ikke rutinemessig brukes, analyse av CTC synes å være svært lovende i tilfelle av molekylær og fenotypiske karakterisering, prognose, og prediktiv betydning i lungekreft (via DNAseq, RNAseq, miRNA og proteinanalyse). Faktisk, CTC sannsynlig Harbor fenotypiske karakteristikker av den aktive sykdommen i stedet for den første markører (påvist på vev biopsier ved diagnose). Videre CTC omgå problemet med romlig heterogenitet av tumor vev, som kan være en avgjørende sak i små biopsier. Følgelig kan PD-L1-uttrykk på CTC potensielt kaste lys over avvikene avledet fra bruken som en prediktiv biomarkør ved hjelp av tumor vev.

Nylig har PD-L1-uttrykket blitt testet i CTC av NSCLC. Nesten alle pasientene testet⁹ var PD-L1-positive, kompliserer tolkningen av resultatet og dens klinisk bruk. Samlet, PD-L1-positive CTC ble påvist i 69,4% av prøvene fra et gjennomsnitt på 4,5 celler/mL¹⁰. Etter initiering av strålebehandling, andelen av PD-L1-positive CTC økt betydelig, noe som indikerer oppregulering av PD-L1 uttrykk som svar på stråling¹¹. Derfor kan PD-L1 CTC analyse brukes til å overvåke dynamiske endringer av tumor og immunrespons, som kan gjenspeile responsen til kjemoterapi, stråling, og sannsynlige immunterapi (IT) behandlinger.

Hittil CTC isolasjon og PD-L1 karakterisering stole på ulike metoder som anti-EpCAM-belagt magnetisk perle-baserte CTC fange, berikelse-Free basert analysen, og størrelse-basert^12,13 CTC fangst analyser. Imidlertid ble CTC bare påvist i 45%-65% av pasientene med metastatisk NSCLC, og dermed begrense deres evne til å gi informasjon for mer enn halvparten av metastatisk NSCLC-pasienter. I tillegg var CTC-tellingen lav i de fleste av disse studiene ved hjelp av størrelsesbasert tilnærming¹⁰. Videre har denne metoden ført til uoverensstemmelser som påvisning av CD45 (-)/DAPI (+) celler med “cytomorphological mønstre av kreft” i blodet av sunne donorer. Disse bekymringene fremhever behovet for en svært følsom metode for CTC-kolleksjon forbundet med immun-bestemmelse av fenotype av atypiske CD45 (-) celler fra sunt hele blod ved hjelp av ekstra kreft biomarkører (dvs. TTF1, vimentin, EpCAM og CD44) i NSCLC.

Følgelig evaluerte vi en spiral mikrovæskebasert enhet som bruker treghet og Dean dra styrker til separate celler basert på størrelse og plastisitet gjennom en mikrovæskebasert chip. Dannelsen av Dean Vortex renn til stede i mikrovæskebasert chip resulterer i større CTC plassert langs den indre veggen og mindre immunceller langs ytterveggen av brikken. Den berikelse prosessen er fullført ved siphoning de større cellene i samlingen uttaket som beriket CTC brøk. Denne metoden er spesielt følsom og spesifikk (påvisning av rundt 1 CTC/mL av hele blod)¹⁴ og kan knyttes til tilpassede IMMUNOFLUORESCENCE (IF)-analyser. Disse verktøyene vil gjøre det mulig å sette opp en positiv terskel for klinisk tolkning. En arbeidsflyt er således beskrevet som gjør det mulig for biologer å isolere og immunophenotype CTC med høy grad av restitusjon og spesifisitet. Protokollen beskriver optimal bruk av spiral mikrovæskebasert enheten for å samle CTC, den optimaliserte IF-analysene som kan tilpasses etter krefttype, og bruk av gratis åpen kilde-programvare for å måle og analysere celle bilder for å utføre en halvautomatisk numeration av cellene i henhold til fluorescerende flekker. I tillegg kan mikroskop multipleksing utføres avhengig av antall fluorescerende filtre/markører tilgjengelig.

Protocol

Prøvene ble prospektivt samlet innenfor rammen av CIRCAN (“sirkulerende kreft”) kohort basert ved Lyon universitetssykehus etter pasientens skriftlige samtykke. Denne studien ble integrert i CIRCAN_ALL-kohort. Studien CIRCAN_ALL ble anerkjent som ikke-interventional av CPP South-East IV datert 04/11/2015 under referanse L15-188. En endret versjon ble anerkjent som ikke-interventional på 20/09/2016 under henvisning L16-160. Den CIRCAN_ALL studien ble erklært til IT og frihets korrespondent for Hospices civils de Lyon p…

Representative Results

Den første forutsetning var å få uforurenset (smittsomme agent-Free) samlinger av CTC for vev kultur og unngå IF bakgrunn generert. Rense protokollen aktivert rengjøring av alle rør og pumper, og det resulterte i innsamling av CTC med en god utvinningsgrad uten bakteriell forurensning. De beriket prøvene ble sammenlignet uten og med rensing protokollen arbeidsflyten av spiral mikrovæskebasert enheten. For å validere rense protokollen, A549 cellelinjen ble brukt i fravær av hele blod og beriket direkte ved hjelp…

Discussion

To store punkter ble reist i denne studien, den første med hensyn til utførelsen av arbeidsflyten for overføring til kliniske applikasjoner, og den andre om nedgangen i subjektivitet for analyse av fluorescens bilder innhentet.

En effektiv og optimalisert arbeidsflyt for CTC-opplisting ble opprinnelig bestemt ved hjelp av passelig IF-analyse etter celle berikelse via en CTC-etikett uten mikrovæskebasert system (spiral mikrovæskebasert enhet). Ved hjelp av denne arbeidsflyten, bekreftet en…

Materials

4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4°C
BD Facs Clean – 5L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4°C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4°C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4°C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4°C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4°C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone – 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4°C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4°C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4°C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4°C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4°C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4°C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4°C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software