Summary
Представленный метод сочетает в себе количественный анализ двухструйных разрывов ДНК (DSB), распределения клеточного цикла и апоптоза, позволяющих проводить оценку индукции и ремонта клеточного цикла DSB, а также последствия отказа от ремонта.
Abstract
Представленный метод или слегка измененные версии были разработаны для изучения конкретных ответов на лечение и побочных эффектов различных противораковых методов лечения, используемых в клинической онкологии. Это позволяет количественно и продольный анализ ответ повреждения ДНК после генотоксического стресса, как индуцированные лучевой терапии и множество противораковых препаратов. Метод охватывает все этапы реакции повреждения ДНК, обеспечивая конечные точки для индукции и ремонта двухструйных разрывов ДНК (DSBs), ареста клеточного цикла и смерти клеток апоптозом в случае отказа ремонта. Объединение этих измерений предоставляет информацию о клеточном цикле зависимых последствий лечения и, таким образом, позволяет углубленное изучение взаимодействия между клеточной пролиферации и борьбы механизмов против повреждения ДНК. Поскольку эффект многих терапевтических средств рака, включая химиотерапевтические агенты и ионизирующее излучение, ограничен или сильно варьируется в зависимости от конкретных фаз клеточного цикла, коррелятивные анализы опираются на надежный и осуществимый метод оценки последствий лечения ДНК в клеточном цикле-специфическим образом. Это невозможно с помощью анализов с одной точкой и важным преимуществом представленного метода. Метод не ограничивается какой-либо конкретной клеточной линии и был тщательно протестирован во множестве опухолей и нормальных линий клеток ткани. Он может быть широко применен в качестве всеобъемлющего исследования генотоксичности во многих областях онкологии, кроме радиоонкологии, включая оценку фактора риска окружающей среды, скрининг аттестата и оценку генетической нестабильности в опухолевых клетках.
Introduction
Целью онкологии является убийство или инактивация раковых клеток без ущерба для нормальных клеток. Многие методы лечения прямо или косвенно вызывают генотоксический стресс в раковых клетках, но и некоторые распространяются в нормальных клетках. Химиотерапия или целевые препараты часто сочетаются с лучевой терапиейдля повышения радиочувствительности облученной опухоли 1,2,3,5,что позволяет снизить дозы облучения, чтобы свести к минимуму нормальное повреждение тканей.
Ионизирующее излучение и другие генотоксические агенты вызывают различные виды повреждений ДНК, включая базовые модификации, поперечные ссылки нити и разрывы с одной или двойной нитью. Разрывы ДНК двойной нити (DSBs) являются наиболее серьезными поражениями ДНК и их индукции является ключом к клеточной смерти эффект ионизирующего излучения и различных цитостатических препаратов в радиохимиотерапии. DSB не только вредят целостности генома, нои способствуют образованию мутаций 6,7. Таким образом, различные пути ремонта DSB, и механизмы для устранения непоправимо поврежденных клеток, как апоптоз разработали в ходе эволюции. Вся реакция повреждения дна (DDR) регулируется сложной сетью сигнальных путей, которые достигают от распознавания повреждений ДНК и ареста клеточного цикла, чтобы позволить для ремонта ДНК, запрограммированной смерти клетки или инактивации в случае отказа ремонта8.
Представленный цитометрический метод потока был разработан для исследования DDR после генотоксического стресса в одном комплексном исследовании, который охватывает индукцию и ремонт DSB, а также последствия отказа ремонта. Он сочетает в себе измерение широко применяемого маркера DSB ЗH2AX с анализом клеточного цикла и индукцией апоптоза, используя классический анализ subG1 и более конкретную оценку активации caspase-3.
Сочетание этих конечных точек в одном анализе не только уменьшает время, затраты на рабочую силу и затраты, но и позволяет измерять и восстанавливать цикл клеточного цикла индукции и ремонта DSB, а также активацию caspase-3. Такие анализы были бы невозможны при независимо множетесь анализы, но они весьма актуальны для всестороннего понимания реакции повреждения ДНК после генотоксического стресса. Многие противораковые препараты, такие как цитостатические соединения, направлены против деления клеток, и их эффективность сильно зависит от стадии клеточного цикла. Наличие различных процессов ремонта DSB также зависит от стадии цикла ячейки и выбора пути, который имеет решающее значение для точности ремонта, и, в свою очередь, определяет судьбу ячейки9,10,11, 12. Кроме того, измерение уровня DSB в клеточном цикле является более точным, чем объединенный анализ, поскольку уровни DSB зависят не только от дозы генотоксического соединения или радиации, но и от содержания ДНК клетки.
Метод был использован для сравнения эффективности различных радиотерапий для преодоления механизмов сопротивления в глиобластоме13 и для вскрытия взаимодействия между ионизирующим излучением и целевыми препаратами при остеосаркоме14,15 и нетипичные тератоидные раки раков16. Кроме того, описанный метод был широко использован для анализа побочных эффектов радио- и химиотерапии на мезенхимальных стволовых клетках17,18,19,20,21, 22,23,24, которые необходимы для ремонта лечения индуцированных нормальных повреждений тканей и имеют потенциальное применение в регенеративной медицине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
-
Приготовьте 1 x 105 ячеек/образец в любом типе сосуда культуры в качестве исходного материала.
- Например, проведите эксперимент по временному курсу после воздействия клеток глиобластомы U87 на ионизирующее излучение: Облучение подсливающих сярть ячеек U87 в флягах T25 в триплицатах для каждого временного момента. Выберите ранние временные точки (15 мин до 8 ч после облучения), чтобы следовать кинетике ремонта DSB (уровень H2AX) и поздним тайм-пойнтам (24 ч до 96 ч) для оценки остаточных уровней DSB, эффектов клеточного цикла и апоптоза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол не ограничивается облучением экспериментов или какой-либо конкретной линии клеток. Он был протестирован с многочисленными клеточными линиями всех типов, от различных видов и для различных условий лечения.
- Например, проведите эксперимент по временному курсу после воздействия клеток глиобластомы U87 на ионизирующее излучение: Облучение подсливающих сярть ячеек U87 в флягах T25 в триплицатах для каждого временного момента. Выберите ранние временные точки (15 мин до 8 ч после облучения), чтобы следовать кинетике ремонта DSB (уровень H2AX) и поздним тайм-пойнтам (24 ч до 96 ч) для оценки остаточных уровней DSB, эффектов клеточного цикла и апоптоза.
-
Подготовьте следующие решения, включая 10% избыточный объем.
- Подготовьте 2 мл на образец раствора фиксации, состоящего из 4,5% параформальдегида (PFA) в фосфатно-буферизированном сольне (PBS). Приготовьте раствор свежим. Разбавить ПФАС в PBS путем нагрева до 80 градусов с медленным перемешиванием под капотом дыма. Обложка колба с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить потерю тепла. Дайте раствору остыть до комнатной температуры и отрегулируйте конечный объем. Передайте раствор через сложенный целлюлозный фильтр, класс 3hw (см. таблицу материалов).
ПРЕДЕКТО: Пары PFA токсичны. Выполните этот шаг под капотом дыма и утилизировать отходы PFA надлежащим образом. - Приготовьте 3 мл на образец раствора пермяки, состоящего из 70% этанола в ледяном H2O. Хранить при -20 градусов по Цельсию.
- Приготовьте 7 мл на образец стирального раствора, состоящего из 0,5% крупного сывороточного альбумина (BSA) в PBS.
- Подготовьте 100 л на образец 3% BSA в PBS в качестве разбавителя антител.
- Приготовьте 100-250 л на образец раствора окрашивания ДНК, состоящего из 1 мкг/мл 4',6-диамидин-2-фенилиндол (DAPI) в PBS.
- Подготовьте 2 мл на образец раствора фиксации, состоящего из 4,5% параформальдегида (PFA) в фосфатно-буферизированном сольне (PBS). Приготовьте раствор свежим. Разбавить ПФАС в PBS путем нагрева до 80 градусов с медленным перемешиванием под капотом дыма. Обложка колба с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить потерю тепла. Дайте раствору остыть до комнатной температуры и отрегулируйте конечный объем. Передайте раствор через сложенный целлюлозный фильтр, класс 3hw (см. таблицу материалов).
- Установите центрифугу на 15 мл труб до 5 мин при 200 х г и 7 градусов по Цельсию. Пусть центрифуга остынет и использовать эти настройки для всех шагов центрифуги.
2. Коллекция образцов
-
Если обработка клеток адептов (например, клетки глиобластомы U87, выращенные в т25 флягах с 5 мл модифицированной среды Dulbecco, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода при 37 градусах Цельсия и 5% атмосфере двуокиси углерода), продолжайте делать шаги 2.1.1. и 2.1.2. Для подвесных ячеек перейти непосредственно к шагу 2.1.2.
- Соберите средство в центробежную трубку. Отсоединить клетки с помощью обычного метода клеточной культуры, который может включать в себя использование трипсина, этиленедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) или других агентов отслоения клеток.
- Для U87 клеток, претеплый PBS и трипсин / EDTA (см. Таблица материалов) до 37 градусов по Цельсию, мыть клеточного слоя с 1 мл PBS, инкубировать клетки в течение 1-2 мин с 1 мл трипсина / EDTA и поддержки отряда клеток, нажав на колбу. Соберите все стиральные растворы и клеточной подвески в трубке со средой.
- Центрифуги клетки, отбросить среды и resuspend клеток в 1 мл PBS.
- Соберите средство в центробежную трубку. Отсоединить клетки с помощью обычного метода клеточной культуры, который может включать в себя использование трипсина, этиленедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) или других агентов отслоения клеток.
- Pipet клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить одну подвеску ячейки и передать подвеску клетки в трубку с 2 мл раствора фиксации (4,5% PFA/PBS, 3% конечная концентрация).
ПРЕДЕКТО: Пары PFA токсичны. Выполните этот шаг под капотом дыма и утилизировать отходы PFA надлежащим образом. - Инкубировать клетки в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Центрифуги клетки и отбросить супернатант путем decantation.
- Освободите клеточные гранулы, нажав на трубку и resuspend клетки в 3 мл 70% этанола. Продолжайте непосредственно со следующим шагом или храните образцы при 4 градусах По Цельсию в течение нескольких недель.
3. Мытье и окрашивание
- Центрифуги клетки и отбросить супернатант путем decantation.
- Освободите клеточные гранулы, нажав на трубку. Приготовьте клетки в 3 мл стирального раствора (0,5% BSA/PBS), центрифуги и отбросьте супернатант.
- Повторите шаг стирки 1x с 3 мл, а затем 1x с 1 мл стирального раствора. В последнем шаге, отбросить супернатант тщательно пипеттинг. Позаботьтесь, чтобы не аспирировать гранулы.
- Разбавить антитела против ЗГ2АС, фосфо-гистон H3 (Ser10) и caspase-3 (см. таблицуматериалов) в 100 Л/образец с разбавителем антител (3% BSA/PBS).
- Освободите клеточные гранулы, нажав на трубку и resuspend клетки в 100 зл и раствор антитела подготовлены в шаге 3.4. Держите образцы в темноте от этого шага вперед.
- Инкубировать образцы по 1 ч при комнатной температуре.
- Centrifuge клетки и отбросить супернатант тщательно пипетки. Позаботьтесь, чтобы не аспирировать гранулы.
-
Освободите клеточные гранулы, нажав на трубку и повторно притонув клетки в 100-250 л раствора окрашивания ДНК (1 мкг/мл DAPI/PBS).
- Используйте 100 кЛ, если 1-2 x105 клеток присутствуют и увеличить объем для более высоких номеров клеток (250 л для No 1 х 106 клеток). Продолжить непосредственно со следующим шагом или хранить образцы в темноте при 4 градусах По Цельсию в течение 2 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых типов клеток оптимизация концентрации DAPI может помочь улучшить разделение фаз клеточного цикла.
- Используйте 100 кЛ, если 1-2 x105 клеток присутствуют и увеличить объем для более высоких номеров клеток (250 л для No 1 х 106 клеток). Продолжить непосредственно со следующим шагом или хранить образцы в темноте при 4 градусах По Цельсию в течение 2 недель.
- Pipet образцы через крышку ситечко клетки образца трубки с сеткой поры размером 35 мкм.
4. Измерение
- Поместите образцы на лед, запустите цитометр потока (см. таблицуматериалов), настроенную с оптической настройкой в соответствии с таблицей 1 и нажмите кнопку Prime. При необходимости включите ультрафиолетовый лазер (355 нм длина волны) отдельно и установите мощность до 10 мВт с помощью соответствующего программного обеспечения.
- Откройте программное обеспечение для приобретения (см. ТаблицуМатериалов), войдите в систему и создайте новый эксперимент, нажав кнопку New Experiment на панели инструментов Browser.
- Используйте окно Inspector, чтобы настроить название эксперимента и выбрать '5 Log Decades' для отображения сюжета.
- Нажмите кнопку New Specimen в панели инструментов Браузера и расширьте новую запись, нажав символ «К» с левой стороны, чтобы показать первую трубку. Выберите соответствующий значок и тип для переименования Specimen (например, тип ячейки) и трубки (идентификатор образца). Нажмите на указатель трубки первой трубки (стрелоподобный символ слева), чтобы превратить его в зеленый (активный).
- Откройте вкладку Параметры в окне цитометра и выберите параметры в соответствии с таблицей 1. Удалите все ненужные параметры.
ПРИМЕЧАНИЕ: имена параметров могут варьироваться в зависимости от пользовательских пресетов (например, Cy3 вместо Alexa555). Убедитесь, что выбор соответствует оптическим фильтрам и детекторам в таблице1. Световые дорожки всех фторфоров полностью независимы в этой установке и компенсация спектрального перекрытия не требуется; однако, это может быть необходимо, если используется другая оптическая установка. - Откройте окно листа и создайте участки в соответствии с рисунком 1. Нарисуйте 2 точечных участка и 4 гистограммы с помощью соответствующих кнопок панели инструментов и нажмите на метки оси, чтобы выбрать соответствующие параметры (фронтальный рассеяние (FSC-A) против бокового рассеяния (SSC-A), DAPI-W против DAPI-A и гистограммы для DAPI-A и каждого антитела-связанного фторофор.
- Прикрепите образец управления к цитометру и нажмите кнопку Run на инструменте. Выберите первую трубку в окне браузера программного обеспечения и нажмите кнопку «Приобретение данных» в панели мониторинга приобретения. Отрегулируйте громкость впрыска образца с помощью низких, средних или высоких кнопок и тонкого тюнинговающего колеса на инструменте. Предпочтительно работать в низких настройках, но попробуйте приобрести по крайней мере 100 событий в секунду (см. Приобретение Dashboard).
- Отрегулируйте напряжение детектора для FSC, SSC и DAPI во вкладке Параметры окна инспектора, используя точечные участки на рисунке 1 в качестве ориентира. Переключитесь на логарифмическую шкалу для параметров FSC и SSC, если популяция клеток кажется слишком рассеянной в линейной шкале.
- Нажмите кнопку Ожидания на цитометре и продолжайте настройку листа в программном обеспечении.
- Используйте инструмент Polygon Gate для определения популяции ячеек в участке FSC-A против SSC-A и инструменте Rectangle Gate для определения популяции SingleCells в участке DAPI-W против DAPI-A. Нажмите клавиши Ctrl и G, чтобы показать иерархию населения и нажмите на имена ворот по умолчанию, чтобы переименовать их.
- Впоследствии правой кнопкой мыши на все гистограммы и выбрать Показать населения (ru) SingleCells из контекстного меню.
- Оптимизируйте напряжение детектора для флюорофоров, связанных с антителами, чтобы покрыть весь динамический диапазон, впоследствии приобретая контроль ные и обработанные образцы. Увеличьте соотношение сигнала к шуму и избегайте насыщения детектором. Убедитесь, что пик Alexa488 в популяции SingleCells не усечен ни в контрольной, ни обработанной выборке.
- Нажмите кнопку Ожидания на цитометре и дополнительно выполните шаги 4.11.1-4.11.3 в окне листа программного обеспечения, чтобы получить приблизительную оценку последствий лечения во время приобретения образца.
- Выберите SingleCells в иерархии народонаселения и используйте инструмент Rectangle Gate для определения популяции G1 в сюжете DAPI-W по сравнению с сюжетом DAPI-A. Нажмите правой кнопкой мыши на Alexa488 гистограммы и выбрать Показать населения (ru) G1 из контекстного меню.
- Нажмите на гистограмму Alexa488 и выберите «Создайте представление статистики» из контекстного меню. Нажмите на кнопку «Статистика» и выберите представление статистики «Отметуйте». Перейдите на вкладку Статистика и активируйте флажок для медианы сигнала Alexa488 в популяции G1 (деактивировать все другие варианты).
- Выберите SingleCells в иерархии народонаселения и используйте инструмент Interval Gate для определения популяций subG1, M и Casp3 в DAPI-A, Alexa555-A (Cy3-A на рисунке 1) и Алекса647-Гистограммы.
- Нажмите кнопку Run на цитометре и измерьте образцы с помощью панели приобретения в программном обеспечении. Установите остановки ворот для всех событий или ворота клетки (если многочисленные мелкие частицы присутствуют) и количество событий для записи до 10000.
- Нажмите Next Tube, чтобы создать новый образец, переименовать его в окне браузера, нажмите Приобрести данные, чтобы начать приобретение и запись данных, чтобы начать запись.
- Выберите файл Экспорт (англ.) Эксперименты из панели меню и выбрать каталог Экспорт в диалоговом поле для сохранения данных как '.fcs' файлы. Дополнительно сохранить эксперимент в качестве дополнительного почтового файла, если включить реимпорт эксперимента на более поздний момент времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка существующих экспериментов может быть легко использована с помощью edit Дублировать без данных.
5. Оценка данных
- Перетащите и перебросьте файлы '.fcs' в пример браузера программного обеспечения цитометрического анализа потока (см. Таблица материалов). Примените стратегию gating, показанную на рисунке 2. Убедитесь, что ворота подходят для соответствующей популяции во всех образцах, прежде чем приступить к следующей дочери ворот.
- Чтобы применить изменения ко всем образцам, выберите измененные ворота в образе браузера, скопируйте их, нажав на Ctrl sC, выберите родительские ворота, нажмите Ctrl и Shift E, чтобы выбрать эквивалентные узлы во всех образцах и нажмите Ctrl V, чтобы вставить или перезаписать ворота. Не используйте групповые ворота.
- Дважды нажмите на первый образец в браузере, чтобы открыть участок SSC-A против FSC-A. Используйте инструмент Polygon в панели инструментов для определения популяции клеток (рисунок2, участок 1), исключая мусор из анализа. Убедитесь, что ворота достаточно широки к верхнему правому углу для размещения связанных с лечением сдвигов, но ограничить границу, обращенную в левый нижний угол участка, чтобы надежно исключить ячейку.
- Дважды нажмите на ворота ячейки, чтобы открыть новое окно сюжета и изменить оси на DAPI-W (вертикальный) против DAPI-A (горизонтальный), нажав на метки оси. Используйте инструмент Rectangle для определения популяции SingleCells (рисунок2, участок 2), исключая дублеты или комки из анализа (двойники g1-клеток имеют ту же интенсивность DAPI-A, что и G2 и M-клетки, но значительно выше DAPI-W значение).
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение количества клеток в различных образцах вызовет сдвиги в общей силе сигнала DAPI-A из-за равновесного связывания DAPI к ДНК. Это не повлияет на анализ клеточного цикла, но может потребоваться отрегулировать правильную границу образца ворот одной ячейки по выборке для учета этих сдвигов. - Дважды нажмите на ворота SingleCells, чтобы открыть новое окно сюжета и изменить оси, чтобы показать гистограмму DAPI-A. Используйте инструмент Bisector, чтобы отличить одиночные клетки с нормальным содержанием ДНК (популяцияCellCycle) от апоптотических клеток с деградированными ДНК (популяцияsubG1). Затем выберите новые ворота в браузере и нажмите Ctrl и R, чтобы переименовать их соответствующим образом (рисунок2, участок 3).
- Выберите ворота CellCycle в браузере и выберите инструмент Биология Цикл клеток... из панели меню, чтобы открыть инструмент моделирования клеточного цикла. Выберите Dean-Jett-Fox25,26 в разделе Модель для оценки частоты клеток в G1, S и G2/M фазы (Рисунок 2, участок 4). Использовать ограничения только в случае низкой производительности моделирования (минимизировать отклонение корневой средней площади между моделью и данными).
- Создание ворот для G1 (инструментEllipse), S ( инструментПолигон) и G2 и M ( инструментEllipse) в фазе DAPI-W против DAPI-A участка населения CellCycle, чтобы позволить измерению клеточного цикла QH2AX ( Рисунок2, участок 5). Не используйте инструмент моделирования для автоматического цикла клеток gating на основе гистограммы DAPI-A, так как это может быть неточным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется переместить ворота по образцу оси DAPI-A по выборке для учета вышеупомянутых сдвигов в общей силе сигнала DAPI. Только переместить три ворота, как группа и не изменять форму отдельных ворот, чтобы избежать предвзятости. - Используйте инструмент Бисектор для различения фосфо-гистон H3-положительный(M) и -отрицательный (M-) клетки в Alexa555-A гистограмма населения CellCycle (Рисунок2, участок 6). Держите Ctrl и выберите ворота G2 и M-. Пресс Ctrl и сдвиг - A для создания G2 (G2 'M и M-) ворота.
- Используйте инструмент Бисектор, чтобы различать caspase-3-положительный(Casp3)) и -отрицательные(Casp3-) клетки в Alexa647-A гистограмма населения SingleCells (Рисунок 2, участок 7). Установите порог так, что среднее число популяций Casp3 в необработанных элементах управления составляет 0,8%, чтобы обеспечить высокую чувствительность и свести к минимуму вариации анализов.
- Нажмите Ctrl и T, чтобы открыть редактор таблицы и настроить его в соответствии с рисунком 3. Перетащите и перебросьте различные группы из образца браузера в редактор таблицы и дважды нажмите на строки, чтобы изменить настройки статистики, параметра и имен. Удалите ненужные строки, которые автоматически добавляются после перетаскивания и падения значка моделирования клеточного цикла, выбрав строки и нажав Del.
- Выберите Для файла,формат и пункт назначения в разделе Выход ленты меню и нажмите Создать таблицу для экспорта данных в качестве файла '.xlsx'.
- Используйте программное обеспечение для расчета таблицы (см. Таблица материалов) для дальнейшего анализа данных в соответствии с дополнительным файлом 1 (FACS-Analysis-Template(1).xlsx).
- Исправьте частоты клеток в различных фазах цикла клеток таким образом, что их сумма составляет 100%, применяя формулу X' X X Х 100 / (все фазы циклов ячейки), с X': исправленное значение, X: сырое значение, к каждой фазе цикла ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отклонения от суммы 100% происходят из-за неточностей в моделировании клеточного цикла, но, как правило, невелики (злится;5%). - Нормализовать среднюю интенсивность ДНК в различных фазах клеточного цикла, разделив значения фазы S на 1,5, а в фазе G2 и M на 2,0.
- Для расчета комбинированного нормализованного уровня QH2AX во всей популяции клеток, используйте формулу IA - IG1 - G1 - IS s - IG2 - G2 , IM , где яA, IG1, IS, IG2, IM нормализованы медианные интенсивности H2AX всех, G1, S, G2, M-клетки соответственно и G1, S, G2, M исправляются частота клеток в соответствующей фазе цикла ячейки.
- Для нормализованных уровней H2AX и частоты subG1 и caspase-3-положительных ячеек вычесть среднее значение необработанных элементов управления из каждого образца.
- Рассчитать среднее и стандартное отклонение каждого параметра от всех образцов репликации и наложить результаты на диаграммы.
- Исправьте частоты клеток в различных фазах цикла клеток таким образом, что их сумма составляет 100%, применяя формулу X' X X Х 100 / (все фазы циклов ячейки), с X': исправленное значение, X: сырое значение, к каждой фазе цикла ячейки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки глиобластомы человека U87 или LN229 были облучены 4 Ги фотонного или углеродного ионного излучения. Уровни циклического цикла и апоптоза были измерены в разных временных точках до 48 ч после облучения с помощью цитометрического метода потока, представленного здесь(рисунок 3). В обеих клеточных линиях ионы углерода индуцировали более высокие пиковые уровни H2AX, которые снизились медленнее и оставались значительно повышенными на 24 до 48 ч по сравнению с фотонным излучением в той же физической дозе (Рисунок 4A). Это показало, что ионы углерода индуцировали более высокие пиковые уровни разрывов ДНК с двойными нитями (DSB), чем фотоны, которые были отремонтированы менее эффективно. Для обоих типов излучения уровни ЗН2АКС были самыми высокими в клетках G1, вероятно, потому, что ремонт DSB ограничен пути негомологического конечного присоединения на данном этапе клеточного цикла.
В соответствии с более высокой скоростью индукции DSB и более медленным ионами ремонта, ионы углерода индуцировали более сильный и более длительный арест клеточного цикла в фазе G2(Рисунок 3B) и более высокий уровень апоптоза, чем фотоны (Рисунок4C). Таким образом, углеродное ионное излучение может помочь преодолеть механизмы радиорезистентности, наблюдаемые при глиобластоме при классической лучевой терапии фотонами (см. Лопес Перес, и др.1 для детального обсуждения).
Результаты, показанные на рисунке 4, являются примерами оптимального результата этого метода, показывающие явные различия между необработанными и облученных клетками и статистически значимые дифференциальные эффекты между различными методами лечения. В тех случаях, когда индукция DSBs и апоптоза менее ясна, важно включить положительный контроль. Как показано здесь, клетки фиксированной 1 ч после фотон облучения являются хорошими положительными элементами управления для индукции H2AX. Фотон-излучение также известно, эффективно вызвать апоптоз в лимфоцитах, что делает их полезными в качестве положительного контроля для апоптоза 2-4 дней после облучения. Другая возможность заключается в использовании препаратов для индукции апоптоза, таких как ингибитор протеасомы MG132 или лиганд рецептора смерти(рисунок 5).
Другим важным аспектом для оптимального результата анализ является качество профилей клеточного цикла. На рисунке 4B пики G1 и G2 были узкими и четко разделенными, что упрощало применение моделирования клеточного цикла и определение ворот для измерения клеточного цикла в области qH2AX. В зависимости от типа клетки и силы эффекта лечения(Рисунок 6A,B), разрешение различных фаз клеточного цикла может быть значительно хуже. В некоторых случаях концентрация DAPI оказывает большое влияние на качество профиля клеточного цикла и нуждается в корректировке(рисунок 6C). В тех случаях, когда из-за лечения не обнаруживается четкий пик G1, инструмент моделирования клеточного цикла не может быть применен точно. Рекомендуется использовать только ручной gating в DAPI-A по сравнению с DAPI-W участок на основе элементов управления с четко определенным профилем цикла ячейки, как описано в протоколе.
Анализ профиля клеточного цикла без четкого пика G1 может быть еще более сложным, если лечение приводит к низким числам клеток, что приводит к большим изменениям в общей силе сигнала DAPI. В этой ситуации, это может быть трудно судить, если пик G1 или G2 пик. Чтобы избежать этой проблемы, клетки могут быть подсчитаны с камерой Neubauer или другими средствами после последнего шага стирки (шаг 3.3) и номера клетки можно отрегулировать. Пиковые позиции в обработанных ячейках будут совпадать с элементами управления.
Рисунок 1 : Настройка рабочего листа для приобретения образца. Участки и ворота для отображения сигнала в окне листа программного обеспечения цитометра потока (см. Таблицу Материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Стратегия Gating для оценки данных. Дерево населения и диаграммы, показывающие, как ворота настроены для определения различных субпопуляций в программном обеспечении цитометрического анализа потока. DJF относится к инструменту моделирования клеточного цикла с использованием метода Dean-Jett-Fox25,26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Таблица экспорта исходных данных. Настройка "Таблица редактора" для экспорта необработанных данных в программном обеспечении цитометрического анализа потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Ответ повреждения ДНК человеческих U87 и LN229 глиобластомы клеток после облучения с 4 Gy фотона против углеродного ионного излучения. (A) Индукция И реабиремонта DSB измеряется уровнями H2AX. Средняя интенсивность флуоресценции была нормализована к относительному содержанию ДНК в каждой фазе клеточного цикла (G1 No 1,0, S - 1,5, G2 и 2.0) и были вычтены уровни контроля. Символы указывают на средние и бары ошибок, указывающие значения SD. Твердые линии представляют пригонки в соответствии с функцией I(t) (p1't2 и p2't) / (t2 , q1't q2) t 0, p1 злт; 0, p1, q1, q2 (B) Распределение цикла клетки (средний и SD) и репрезентативная гистограмма маркера содержания ДНА DAPI на 24 h после облучения фотона или углерода иона. (C) Индукция апоптоза, измеренная caspase-3 и subG1 положительными клетками (средним и SD). П.л.; 0,05, ЗП злт; 0,01, ЗПЗ Злт; 0,001 (двухсторонний студенческий тест). Эта цифра была изменена с Лопес, и др.1 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : При посредничестве наркотиков апоптоз-индукция в клетках глиобластомы U87. Клетки U87 были обработаны с 5 нг/мл модифицированного TNF связанных апоптоз вызывающих лиганд (см. Таблица материалов) плюс 2,5 мкм MG132 за 20 ч до фиксации для проверки измерения апоптоза активным caspase-3 и subG1 анализа. (A) Гистограмма caspase-3 сигналобработанных против необработанных клеток. (B) DAPI гистограмма обработанных клеток с популяцией subG1, что указывает на деградацию ДНК. Гистограмма каспазы-3-позитивных событий накладывается красным цветом, демонстрируя, что большинство апоптотических клеток еще не деградировали их ДНК в этот момент времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Факторы, влияющие на качество профилей клеточного цикла. Слишком суровые методы лечения усложняют анализ клеточного цикла. (A) Нет G1 пик обнаруживается 48 ч после лечения клеток LLC (Льюис легочной карциномы) с 20 Gy фотонного излучения или (B) 96 ч после лечения HS68 фибробластов с 100 мДж УФ-излучения. (C) Концентрация DAPI в различных клеточных линиях: В HS68 фибробластов (верхняя панель) G2 /M пик (см. стрелки) был одинаково хорошо отделен от пика G1 для концентрации DAPI между 0,01 и 1,0 мкг/мл. В отличие от этого, концентрации DAPI ниже 0,75 мкг/мл привели к плохому разделению и определению формы пика G2/M (см. стрелки) в фибробластах MRC-5 (нижняя панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Типичная конфигурация цитометра потока. Длина волны excitation лазера, U й напряжение детектора, журнал - log- logarithmic маштаб (иначе линейная), -A зона сигнала, -H - максимальная высота сигнала, -W - ширина сигнала (длительность), FSC - передний разброс, SSC - боковой рассеяние. Спецификации оптического фильтра приведены в качестве центральной длины волны/ширины полосы движения в нанометрах. Настройки могут варьироваться для различных цитометров потока и напряжения детектора должны быть скорректированы для различных клеточных линий.
Дополнительная диаграмма 1: Микроскопические изображения очагов ЗН2АС. Клетки U87 были облучены различными дозами фотонного излучения, фиксированными и окрашенными после 30 минут в соответствии с представленным протоколом и подготовлены к микроскопии, как описано в ходе обсуждения. На 2 Gy, отдельные очаги могут быть легко различимы, в то время как на 8 Gy foci подсчет был предвзятым из-за значительного перекрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рекомендуемый метод прост в использовании и предлагает быстрое, точное и воспроизводимое измерение реакции повреждения ДНК, включая двухстротный разрыв (DSB) индукции и ремонта, эффекты клеточного цикла и апоптотические клеточные смерти. Сочетание этих конечных точек обеспечивает более полное представление об их взаимосвязях, чем отдельные анализы. Метод может быть широко применен в качестве комплексного исследования генотоксичности в области радиационной биологии, терапии и защиты, и в более общем плане в онкологии (например, для оценки экологического фактора риска, скрининга наркотиков и оценки генетической нестабильности опухолевых клеток).
Наиболее важным шагом в этом протоколе является фиксация ячеек. Для получения чистого образца с четко определенной популяцией клеток и оптимальным разрешением различных фаз клеточного цикла, важно дать клеткам-адептам достаточно времени, чтобы отделиться от сосуда культуры и сформировать полностью круглую форму. Клетки должны быть переданы в раствор фиксации в виде одноклеточной подвески без клеточных сгустков. Чтобы отделить их, клетки должны быть пипсированные вверх и вниз или прошли через тонкую иглу несколько раз в сложных случаях. Время фиксации должно быть постоянным между всеми образцами и не должно превышать 20 мин, включая время центрифугации до возобновления клеток в 70% этанола. Длительная фиксация приведет к потере доступных эпитопов для связывания антител и уменьшит силу сигнала и чувствительность метода.
Основным ограничением этого метода является то, что он не предоставляет информацию о качестве очагов З2АКС, за исключением интенсивности всего ядра. Особенно большие очаги HH2AX, а также появление панъядерного окрашивания H2AX были связаны с кластерными DSBs1,27,28,29, которые являются очень сложными поражениями, которые являются очень трудными для ремонта30. Такие кластерные поражения, как представляется, характерны для излучения частиц, таких как клинически примененное ионное излучение углерода и может быть причиной превосходной биологической эффективности тяжелого ионного излучения по сравнению с фотонами31,32 ,33. Таким образом, анализ размера очагов foci З2АКС может представлять интерес в качестве индикатора сложности повреждения. Несмотря на то, что для визуализации фокуса H2AX можно использовать настоящий протокол с помощью цитометра потока изображения, достижимое разрешение не может конкурировать с классическим микроскопическим подходом. Тем не менее, мы успешно подготовили микроскопические слайды из оставшихся образцов после цитометрического измерения потока (Дополнительныйрисунок1) и оценили несколько особенностей, включая количество очагов, размер и панядерную интенсивность с использованием полуавтоматизированная система визуализации и анализа. Для подготовки образцов для микроскопии, 30-50 л окрашенных клеток были распространены по поверхности 24 мм х 24 мм крышка стекла, воздух высохна на ночь при комнатной температуре в темноте, а затем встроенный с монтажом среды на стеклянной горке.
По сравнению с микроскопической оценкой уровней DSB по подсчету очагов h2AX, цитометрическое измерение потока превосходит по пропускной записи, частоте отбора проб, динамическому диапазону и точности. Динамический диапазон микроскопического подсчета фоци ограничен оптическим разрешением, что приводит к невозможности различать перекрывающиеся очаги29,34. На практике, мы наблюдали линейную связь между дозой радиации и foci номера H2AX ниже 2 Gy, и сильный эффект насыщения выше 2 Gy в клетках глиобластомы U871. В отличие от этого, интенсивность сигнала ЗH2AX измеряется поток цитометрии увеличивается линейно с дозой для всего диапазона дозы испытания (0-8 Gy).
Точность микроскопического подсчета фоци ограничена неспособностью различать различные фазы клеточного цикла без дополнительных окрашивания35. Количество DSBs индуцированных в клетке зависит не только от дозы облучения, но и от содержания ДНК, и, следовательно, стадии клеточного цикла. Например, у клеток G2 в два раза больше ДНК, чем у клеток G1, а среднее количество DSB, индуцированных в определенной дозе радиации, в два раза выше для клеток G2 по сравнению с G1. Это отчетливо отражено в интенсивности сигнала NoH2AX клеток G2 против G1 в ранние моменты времени после излучения, измеряемого цитометрией потока. Поэтому важно оценить уровни DSB в клеточном цикле-специфическом порядке для получения точных результатов. Объединенный анализ клеток в различных фазах клеточного цикла, как обычно в микроскопических подходах, может быть предвзятым сдвигами в распределении клеточного цикла, особенно из-за радиационного ареста G2. Для учета этого эффекта и сравнения характеристик ремонта DSB между различными этапами клеточного цикла уровни З2АКС могут быть легко нормализованы к содержанию ДНК в методе цитометрии потока, как указано в протоколе.
Продление настоящего протокола возможно при относительно небольших дополнительных усилиях. Дополнительные антитела с совместимыми флюорофорами этикетки могут быть включены в шаг 3.4 без необходимости каких-либо дополнительных шагов во время подготовки образца. Если более детальный анализ апоптоза желательно, caspase-7, -9 и -8 антител могут быть включены. В качестве еще одного расширения, мы недавно включили живой и мертвый краситель клеток, антитела тропонина T и подсчета бусин в протоколе, чтобы специально проанализировать кардиомиоциты совместно культивированные с фибробластами после облучения. Добавление живого/мертвого пятна клетки и подсчитывая шарики расширяет способность метода включить пролиферацию fibroblast и не-апоптотическую смерть клетки cardiomyocytes как более дополнительные конечные точки которые обеспечивают полезную дополнительную информацию на клетке судьба после генотоксического стресса. Расширенный протокол доступен по запросу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим команду Flow Cytometry Facility в Немецком онкологическом научно-исследовательском центре (DKF) за их поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1,000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| Folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
