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Cancer Research

Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/59968
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1CCU Molecular and Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 2Department of Radiation Oncology, Heidelberg University Hospital, 3Department of Radiation Oncology, Freiburg University Medical Center

Summary

Il metodo presentato combina l'analisi quantitativa delle interruzioni del DNA a doppio filamento (DSB), la distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi per consentire la valutazione specifica del ciclo cellulare dell'induzione e della riparazione di DSB, nonché le conseguenze del fallimento della riparazione.

Abstract

Il metodo presentato o versioni leggermente modificate sono state ideate per studiare risposte specifiche al trattamento e gli effetti collaterali di vari trattamenti anti-cancro utilizzati nell'oncologia clinica. Consente un'analisi quantitativa e longitudinale della risposta al danno del DNA dopo lo stress genotossico, come indotto dalla radioterapia e da una moltitudine di farmaci anti-cancro. Il metodo copre tutte le fasi della risposta al danno del DNA, fornendo endpoint per l'induzione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA (DSB), l'arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare per apoptosi in caso di guasto di riparazione. La combinazione di queste misurazioni fornisce informazioni sugli effetti di trattamento dipendenti dal ciclo cellulare e consente quindi uno studio approfondito dell'interazione tra la proliferazione cellulare e i meccanismi di coping contro il danno al DNA. Poiché l'effetto di molte terapie contro il cancro, tra cui agenti chemioterapici e radiazioni ionizzanti, è limitato o varia fortemente in base a specifiche fasi del ciclo cellulare, le analisi correlate si basano su un metodo robusto e fattibile per valutare gli effetti del trattamento sul DNA in modo specifico per il ciclo cellulare. Questo non è possibile con i saggi a endpoint singolo e un importante vantaggio del metodo presentato. Il metodo non è limitato a nessuna linea cellulare particolare ed è stato accuratamente testato in una moltitudine di linee tumorali e normali delle cellule tissutali. Può essere ampiamente applicato come un test completo di genotossicità in molti campi dell'oncologia oltre alla radio-oncologia, tra cui la valutazione del fattore di rischio ambientale, lo screening farmacologico e la valutazione dell'instabilità genetica nelle cellule tumorali.

Introduction

L'obiettivo dell'oncologia è quello di uccidere o inattivare le cellule tumorali senza danneggiare le cellule normali. Molte terapie o direttamente o indirettamente inducono stress genotossico nelle cellule tumorali, ma anche ad alcuni si estendono nelle cellule normali. La chemioterapia o i farmaci mirati sono spesso combinati con la radioterapia per migliorare la radiosensibilità del tumore irradiato1,2,3,4, 5, che consente una riduzione di la dose di radiazioni per ridurre al minimo i normali danni ai tessuti.

Le radiazioni ionizzanti e altri agenti genotossici inducono diversi tipi di danni al DNA, tra cui modifiche alla base, collegamenti di filamento e rotture a singolo o doppio filamento. Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) sono le lesioni più gravi del DNA e la loro induzione è fondamentale per l'effetto di uccisione delle cellule delle radiazioni ionizzanti e di vari farmaci citostatici nella radiochemioterapia. I DSB non solo danneggiano l'integrità del genoma, ma promuovono anche la formazione di mutazioni6,7. Pertanto, diversi percorsi di riparazione DSB, e meccanismi per eliminare le cellule irreparabilmente danneggiate come l'apoptosi si sono sviluppati durante l'evoluzione. L'intera risposta al danno del DNA (DDR) è regolata da una complessa rete di percorsi di segnalazione che raggiungono il riconoscimento dei danni del DNA e l'arresto del ciclo cellulare per consentire la riparazione del DNA, la morte cellulare programmata o l'inattivazione in caso di guasto di riparazione8.

Il metodo citometrico del flusso presentato è stato sviluppato per studiare la DDR dopo lo stress genotossico in un test completo che copre l'induzione e la riparazione di DSB, nonché le conseguenze del guasto alla riparazione. Combina la misurazione del marcatore DSB ampiamente applicato: HH2AX con l'analisi del ciclo cellulare e l'induzione dell'apoptosi, utilizzando l'analisi classica subG1 e una valutazione più specifica dell'attivazione della caspase-3.

La combinazione di questi endpoint in un'unica analisi non solo riduce le spese di tempo, manodopera e costi, ma consente anche la misurazione specifica del ciclo cellulare dell'induzione e della riparazione di DSB, nonché l'attivazione della caspase-3. Tali analisi non sarebbero possibili con i saggi condotti in modo indipendente, ma sono molto rilevanti per una comprensione completa della risposta al danno del DNA dopo lo stress genotossico. Molti farmaci anticancro, come i composti citostatici, sono diretti contro la divisione delle cellule e la loro efficienza è fortemente dipendente dallo stadio del ciclo cellulare. La disponibilità di diversi processi di riparazione DSB dipende anche dalla fase del ciclo cellulare e dalla scelta del percorso che è fondamentale per la precisione di riparazione, e a sua volta determina il destino della cella9,10,11, 12. Inoltre, la misurazione specifica del ciclo cellulare dei livelli di DSB è più accurata dell'analisi in pool, perché i livelli di DSB non dipendono solo dalla dose di un composto o radiazione genotosi, ma anche dal contenuto di DNA della cellula.

Il metodo è stato utilizzato per confrontare l'efficacia di diverse radioterapie per superare i meccanismi di resistenza nel glioblastoma13 e per analizzare l'interazione tra radiazioni ionizzanti e farmaci mirati nell'osteosarcoma14,15 e tumori teratoidi atipici16. Inoltre, il metodo descritto è stato ampiamente utilizzato per analizzare gli effetti collaterali della radio e della chemioterapia sulle cellule staminali mesenchymale17,18,19,20,21, 22,23,24, che sono essenziali per la riparazione del danno tissutale normale indotto dal trattamento e hanno una potenziale applicazione nella medicina rigenerativa.

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Protocol

1. Preparazione

  1. Preparare 1 x 105 celle / campione in qualsiasi tipo di recipiente di coltura come materiale di partenza.
    1. Ad esempio, condurre un esperimento di percorso temporale dopo l'esposizione delle cellule glioblastoma U87 alle radiazioni ionizzanti: irradiare cellule U87 sub-confluenti in flaconi T25 in triplicati per ogni punto temporale. Scegliere i primi punti temporali (15 min fino a 8 h dopo l'irradiazione) per seguire la cinetica della riparazione di DSB (livello HH2AX) e i punti temporali tardivi (24 h fino a 96 h) per valutare i livelli residui di DSB, gli effetti del ciclo cellulare e l'apoptosi.
      NOT: Il protocollo non è limitato agli esperimenti di irradiazione o a qualsiasi linea cellulare specifica. È stato testato con numerose linee cellulari di tutti i tipi, di specie diverse e per varie condizioni di trattamento.
  2. Preparare le seguenti soluzioni, incluso il 10% di volume in eccesso.
    1. Preparare 2 mL per campione di soluzione di fissazione composta da 4,5% paraformaldeide (PFA) in salina con buffer fosfato (PBS). Preparare la soluzione fresco. Diluire la PFA in PBS riscaldando a 80 gradi centigradi con agitazione lenta sotto il cofano del fume. Coprire il pallone con un foglio di alluminio per evitare perdite di calore. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e regolare il volume finale. Passare la soluzione attraverso un filtro di cellulosa piegato, grado 3hw (vedere la Tabella dei Materiali).
      ATTENZIONE: I fumi PFA sono tossici. Eseguire questo passaggio sotto un cofano di fumi e smaltire i rifiuti PFA in modo appropriato.
    2. Preparare 3 mL per campione di soluzione di permeabilizzazione composta da 70% etanolo in freddo ghiaccio H2O. Conservare a -20 gradi centigradi.
    3. Preparare 7 mL per campione di soluzione di lavaggio composta da 0,5% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS.
    4. Preparare 100 L per campione del 3% di BSA in PBS come diluente anticorpo.
    5. Preparare 100-250 l per campione di soluzione di colorazione del DNA composta da 1 g/mL 4',6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) in PBS.
  3. Impostare la centrifuga per tubi da 15 mL a 5 min a 200 x g e 7 gradi centigradi. Lasciare raffreddare la centrifuga e utilizzare queste impostazioni per tutte le fasi di centrifugazione.

2. Collezione di campioni

  1. Se la lavorazione di cellule aderenti (ad es. cellule glioblastoma U87 coltivate in flaconi T25 con 5 mL del mezzo modificato di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale del 10% a 37 gradi centigradi e 5% di atmosfera di anidride carbonica), proseguire con i passi 2.1.1. e 2.1.2. Per le celle di sospensione procedere direttamente al passaggio 2.1.2.
    1. Raccogliere il mezzo in un tubo di centrifugazione. Staccare le cellule utilizzando un metodo di coltura cellulare di routine, che può includere l'uso di trypsin, acido etilenediaminetraaceacetica (EDTA) o altri agenti di distacco cellulare.
      1. Per le cellule U87, prewarm PBS e trypsin/EDTA (vedi la Tabella deiMateriali) a 37 , lavare lo strato cellulare con 1 mL di PBS, incubare le cellule per 1-2 min con 1 mL di trypsin/EDTA e sostenere il distacco delle celle toccando il pallone. Raccogliere tutte le soluzioni di lavaggio e la sospensione cellulare nel tubo con il mezzo.
    2. Centrifugare le cellule, scartare il mezzo e risospendere le cellule in 1 mL di PBS.
  2. Convogliale più volte su e giù per garantire una sospensione a singola cella e trasferisci la sospensione cellulare in un tubo con 2 mL di soluzione di fissaggio (4,5% PFA/PBS, 3% di concentrazione finale).
    ATTENZIONE: I fumi PFA sono tossici. Eseguire questo passaggio sotto un cofano di fumi e smaltire i rifiuti PFA in modo appropriato.
  3. Incubare le cellule per 10 min a temperatura ambiente.
  4. Centrificare le cellule e scartare il supernatale con la decantazione.
  5. Allenta il pellet cellulare toccando il tubo e risospende nuovamente le cellule in 3 mL del 70% di etanolo. Procedere direttamente con il passo successivo o conservare i campioni a 4 gradi centigradi per un massimo di diverse settimane.

3. Lavaggio e colorazione

  1. Centrificare le cellule e scartare il supernatale con la decantazione.
  2. Allentare il pellet cellulare toccando il tubo. Risospendere le cellule in 3 mL di soluzione di lavaggio (0,5% BSA/PBS), centrifugare e scartare il sovrinterrato.
  3. Ripetere il passaggio di lavaggio 1x con 3 mL, quindi 1x con soluzione di lavaggio da 1 mL. Nell'ultimo passaggio, scartare il supernatante con attenzione pipettando. Fare attenzione a non aspirare il pellet.
  4. Diluire gli anticorpi contro il diluente di anticorpi, il fosfo-histone H3 (Ser10) e la caspase-3 (si veda la Tabella deiMateriali) in 100
  5. Allentare il pellet cellulare toccando il tubo e risospendere le cellule a 100 gradi l della soluzione anticorpale preparata al punto 3.4. Tenere i campioni all'oscuro da questo passo in poi.
  6. Incubare i campioni per 1 h a temperatura ambiente.
  7. Centrifugare le cellule e scartare il supernatante con attenzione pipetting. Fare attenzione a non aspirare il pellet.
  8. Allentare il pellet cellulare toccando il tubo e risospendere le cellule in 100-250 - L di soluzione di colorazione del DNA (1 g/mL DAPI/PBS).
    1. Utilizzare 100 l se sono presenti 1-2 x105 celle e aumentare il volume per i numeri di cella più alti (250 -L per 1 x 106 celle). Procedere direttamente con il passo successivo o conservare i campioni al buio a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.
      NOT: Per alcuni tipi di cellule ottimizzare la concentrazione DI DAPI può contribuire a migliorare la separazione delle fasi del ciclo cellulare.
  9. Pipet i campioni attraverso il tappo del colino cellulare di un tubo campione con una dimensione del poro di maglia di 35 m.

4. Misurazione

  1. Posizionare i campioni sul ghiaccio, avviare il citometro di flusso (vedere la tabella dei materiali) configurato con una configurazione ottica secondo la tabella 1 e premere il pulsante Prime. Se necessario, accendere il laser laser ultravioletto (lunghezza d'onda 355 nm) separatamente e impostare la potenza a 10 mW utilizzando il software appropriato.
  2. Aprire il software di acquisizione (vedere Tabella dei materiali), accedere e creare un nuovo esperimento facendo clic sul pulsante Nuovo esperimento sulla barra degli strumenti del browser.
  3. Utilizzare la finestra Impostazioni per personalizzare il nome dell'esperimento e scegliere "5 Log Decades" per la visualizzazione del grafico.
  4. Fare clic sul pulsante Nuovo campione nella barra degli strumenti del browser ed espandere la nuova voce facendo clic sul simbolo ' ' sul lato sinistro per visualizzare il primo tubo. Selezionare l'icona e il tipo per rinominare l'specimen (ad esempio, il tipo di cella) e il tubo (identificatore del campione). Fate clic sul puntatore del tubo del primo tubo (simbolo a forma di freccia alla sua sinistra) per renderlo verde (attivo).
  5. Aprire la scheda Parametri nella finestra Cytometer e scegliere i parametri in base alla Tabella 1. Eliminare tutti i parametri non necessari.
    NOTA: i nomi dei parametri possono variare a seconda dei predefiniti personalizzati (ad esempio, Cy3 invece di Alexa555). Assicurarsi che la selezione corrisponda ai filtri ottici e ai rilevatori riportati nella Tabella1. I percorsi luminosi di tutti i fluorofori sono completamente indipendenti in questa configurazione e non è richiesta la compensazione della sovrapposizione spettrale; tuttavia, potrebbe essere necessario se viene utilizzata un'altra configurazione ottica.
  6. Aprire la finestra Foglio di lavoro e creare i grafici in base alla figura 1. Disegnare 2 grafici a punti e 4 istogrammi utilizzando i pulsanti della barra degli strumenti corrispondenti e fare clic sulle etichette degli assi per scegliere i parametri appropriati (a dispersione anteriore (FSC-A) rispetto a dispersione laterale (SSC-A), DAPI-W rispetto a DAPI-A e un istogramma per DAPI-A e ogni anticorpo accoppiato fluoroforo.
  7. Collegare un campione di controllo al citometro e premere il pulsante Esegui sullo strumento. Selezionare il primo tubo nella finestra Browser del software e fare clic sul pulsante Acquisisci dati nel Dashboard di acquisizione. Regolare il volume di iniezione del campione utilizzando i pulsanti Basso, Medio o Alto e la ruota di messa a punto sullo strumento. Preferibilmente lavorare con l'impostazione Bassa, ma provare ad acquisire almeno 100 eventi al secondo (vedere Dashboard di acquisizione).
  8. Regolare le tensioni del rivelatore per FSC, SSC e DAPI nella scheda Parametri della finestra Di impostazioni utilizzando i grafici a punti nella Figura 1 come linea guida. Passare alla scala logaritmica per i parametri FSC e SSC se la popolazione cellulare appare troppo dispersa su scala lineare.
  9. Premere il pulsante Standby sul citometro e continuare con la configurazione del foglio di lavoro nel software.
    1. Utilizzare lo strumento Porta poligonale per definire la popolazione di celle nel grafico FSC-A rispetto a SSC-A e lo strumento Rectangle Gate per definire la popolazione SingleCells nel grafico DAPI-W rispetto a DAPI-A. Premere i tasti Ctrl e G per visualizzare la Gerarchia della Popolazione e fare clic sui nomi dei cancelli predefiniti per rinominarli.
    2. Successivamente fare clic con il pulsante destro del mouse su tutti gli istogrammi e scegliere Mostra popolazioni SingleCells dal menu di scelta rapida.
  10. Ottimizzare le tensioni del rivelatore per i fluorofori accoppiati agli anticorpi per coprire l'intera gamma dinamica acquisendo successivamente il controllo e i campioni trattati. Massimizzare il rapporto segnale-rumore ed evitare la saturazione del rilevatore. Assicurarsi che il picco di Alexa488 nella popolazione SingleCells non viene troncato nel controllo né il campione trattato.
  11. Premere il pulsante Standby sul citometro ed eseguire facoltativamente i passaggi 4.11.1-4.11.3 nella finestra Worksheet del software per ottenere una stima approssimativa degli effetti del trattamento durante l'acquisizione del campione.
    1. Selezionare SingleCells nella Gerarchia del popolamento e utilizzare lo strumento Rectangle Gate per definire la popolazione G1 nel grafico DAPI-W rispetto a DAPI-A. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'istogramma di Alexa488 e scegliere Mostra popolazioni. G1 dal menu contestuale.
    2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'istogramma di Alexa488 e scegliere Crea visualizzazione statistiche dal menu di scelta rapida. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla Visualizzazione statistiche e scegliere Modifica visualizzazione statistiche. Vai alla scheda Statistiche e attiva la casella di controllo per la mediana del segnale Alexa488 nella popolazione G1 (disattiva tutte le altre opzioni).
    3. Selezionare SingleCells nella Gerarchia del Popolamento e utilizzare lo strumento Interval Gate per definire le popolazioni subG1, M e Casp3 nel DAPI-A, Alexa555-A (Cy3-A nella Figura 1) e Istogrammi Alexa647-A.
  12. Premere il pulsante Esegui sul citometro e misurare i campioni utilizzando il Dashboard di acquisizione nel software. Impostare il cancello di arresto su Tutti gli eventi o sul cancello Celle (se sono presenti numerose piccole particelle) e sul numero di eventi da registrare a 10.000.
  13. Fare clic su Next Tube per creare un nuovo campione, rinominarlo nella finestra Browser, fare clic su Acquisisci dati per avviare l'acquisizione e Registrare i dati per avviare la registrazione.
  14. Selezionare il file Proprietà Export . Esperimenti dalla barra dei menu e scegliere Esportazione directory nella finestra di dialogo per salvare i dati come file '.fcs'. Facoltativamente, salvare l'esperimento come file zip aggiuntivo se abilitare la reimportingo in un secondo momento.
    NOT: L'impostazione degli esperimenti esistenti può essere facilmente riutilizzata con Modifica Duplica senza dati.

5. Valutazione dei dati

  1. Trascinare i file '.fcs' nel browser di esempio del software di analisi citometrica del flusso (vedere Tabella dei materiali). Applicare la strategia di gating illustrata nella Figura 2. Assicurarsi che i cancelli si adattino alla popolazione corrispondente in tutti i campioni prima di procedere con il cancello della figlia successiva.
    1. Per applicare le modifiche a tutti i campioni, selezionare il gate modificato nel browser di esempio, copiarlo premendo Ctrl , C, selezionare il gate padre, premere Ctrl s Maiusc e E per selezionare i nodi equivalenti in tutti i campioni e premere Ctrl il cancello. Non utilizzare cancelli di gruppo.
    2. Fare doppio clic sul primo campione nel browser per aprire il grafico SSC-A vs FSC-A. Utilizzare lo strumento Poligono nella barra degli strumenti per definire la popolazione di celle (Figura 2, stampa 1), escludendo i detriti dall'analisi. Assicurarsi che il cancello sia sufficientemente largo verso l'angolo superiore destro per accogliere i cambiamenti relativi al trattamento, ma limitare il bordo rivolto verso l'angolo inferiore sinistro del grafico per escludere in modo affidabile la cella.
    3. Fare doppio clic sul cancello Celle per aprire una nuova finestra di stampa e modificare gli assi in DAPI-W (verticale) rispetto a DAPI-A (orizzontale) facendo clic sulle etichette degli assi. Utilizzare lo strumento Rettangolo per definire la popolazione SingleCells (Figura 2, stampa 2), esclusi i doppietti cellulari o i grumi dall'analisi (i doppietti delle celle G1 hanno la stessa intensità DAPI-A delle celle G2 e M, ma un DAPI-W notevolmente superiore valore).
      NOT: Variare il numero di cellule in campioni diversi causerà cambiamenti nella potenza complessiva del segnale DAPI-A a causa del legame di equilibrio di DAPI al DNA. Ciò non influirà sull'analisi del ciclo cellulare, ma potrebbe essere necessario regolare il bordo destro del campione della porta a cella singola per campione per tenere conto di questi turni.
    4. Fare doppio clic sul cancello SingleCells per aprire una nuova finestra di stampa e modificare gli assi per visualizzare l'istogramma DAPI-A. Utilizzare lo strumento Bisector per distinguere singole cellule con contenuto di DNA normale (popolazioneCellCycle) da cellule apoptotiche con DNA degradato ( popolazionesubG1). Successivamente selezionare i nuovi gate nel browser e premere Ctrl e R per rinominarli di conseguenza ( Figura2, stampa 3).
    5. Selezionare il cancello CellCycle nel browser e scegliere Strumento La biologia Ciclo cellulare... dalla barra dei menu per aprire lo strumento di modellazione del ciclo cellulare. Scegliere Dean-Jett-Fox25,26 nella sezione Modello per stimare la frequenza delle celle nella fase G1, S e G2/M (Figura2, stampa 4). Utilizzare i vincoli solo in caso di scarse prestazioni di modellazione (ridurre al minimo la deviazione square della media radice tra il modello e i dati).
    6. Creare cancelli per G1 (strumentoEllisse), S (strumentoPoligono) e G2 ( strumentoEllisse) nella fase DAPI-W rispetto a DAPI-A della popolazione CellCycle per abilitare la misurazione specifica del ciclo cellulare - Figura 2, traccia 5). Non utilizzare lo strumento di modellazione per l'gating automatico del ciclo cellulare basato sull'istogramma DAPI-A, in quanto ciò può essere impreciso.
      NOT: Potrebbe essere necessario spostare i cancelli lungo il campione dell'asse DAPI-A per campione per tenere conto dei suddetti cambiamenti nella potenza complessiva del segnale DAPI. Spostare solo i tre cancelli in gruppo e non modificare la forma delle singole porte per evitare pregiudizi.
    7. Utilizzare lo strumento Bisettore per distinguere le celle fosfo-istone H3 positivo (M ) e -negativo (M-) nell'istogramma Alexa555-A della popolazione di CellCycle (Figura 2, grafico 6). Tenere premuto Ctrl e selezionare i cancelli G2 e M e M-. Premete Ctrl (Windows) o Maiusc (Mac OS) per creare il cancello G2 (G2-M e M-).
    8. Utilizzare lo strumento Bisettore per distinguere le celle caspase-3-positive (Casp3) e -negative (Casp3-) nell'istogramma Alexa647-A della popolazione SingleCells (Figura 2, traccia7). Impostare la soglia in modo che la media della popolazione Casp3 o nei controlli non trattati sia pari allo 0,8% per assicurare un'elevata sensibilità e ridurre al minimo le variazioni di analisi-analisi.
    9. Premete Ctrl e T per aprire l'Editor tabelle e configurarlo in base alla Figura 3. Trascinare e rilasciare le diverse popolazioni dal browser di esempio nell'Editor tabelle e fare doppio clic sulle righe per modificare le impostazioni statistiche, parametri e nomi. Rimuovere le righe non necessarie che vengono aggiunte automaticamente dopo il trascinamento dell'icona di modellazione del ciclo di celle selezionando le righe e premendo CanC.
    10. Scegliere File, il formato e la destinazione nella sezione Output della barra multifunzione del menu e fare clic su Crea tabella per esportare i dati come file 'xlsx'.
  2. Utilizzare il software di calcolo delle tabelle (vedere Tabella dei materiali) per un'ulteriore analisi dei dati in base al file supplementare 1 (FACS_Analysis_Template_(1).xlsx).
    1. Correggere le frequenze delle cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare in modo che la loro somma sia pari al 100% applicando la formula X' X , X , 100 / (tutte le fasi del ciclo cellulare), con X': valore corretto, X: valore non elaborato, a ogni fase del ciclo cellulare.
      NOT: Le deviazioni da una somma del 100% si verificano a causa di imprecisioni nella modellazione del ciclo cellulare, ma sono in genere piccole (<5%).
    2. Normalizzare le intensità medianeH2AX al contenuto di DNA nelle diverse fasi del ciclo cellulare dividendo i valori nella fase S per 1,5 e in fase G2 e M per 2,0.
    3. Per calcolare il livello combinato normalizzato di H2AX nell'intera popolazione cellulare, utilizzare la formula IA , IG1 , G1 , I, S , I, G2 , IM , dove IA, IG1, I,IG2, IM sono normalizzate intensità medianeH2AX di tutti, G1, S, G2, M rispettivamente e G1, S, G2, M sono corrette frequenza delle cellule nella rispettiva fase del ciclo cellulare.
    4. Per i livelli normalizzati di zH2AX e la frequenza delle cellule subG1 e caspase-3-positive, sottrarre il valore medio dei controlli non trattati da ciascun campione.
    5. Calcolare la media e la deviazione standard di ogni parametro da tutti i campioni di replica e tracciare i risultati in diagrammi.

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Representative Results

Le cellule glioblastoma umane U87 o LN229 sono state irradiate con 4 Gy di radiazione fotonica o ionica di carbonio. I livelli e l'apoptosi specifici del ciclo cellulare sono stati misurati in diversi momenti fino a 48 h dopo l'irradiazione utilizzando il metodo citometrico del flusso , qui presentato (Figura 3). In entrambe le linee cellulari, gli ioni di carbonio indottero livelli di picco più alti di H2AX che diminuirono più lentamente e rimasero significativamente elevati a 24 a 48 h rispetto alle radiazioni fotone alla stessa dose fisica (Figura 4A). Ciò ha indicato che gli ioni di carbonio hanno indotto livelli di picco più elevati di rotture del DNA a doppio filamento (DSB) rispetto ai fotoni che sono stati riparati in modo meno efficiente. Per entrambi i tipi di radiazioni, i livelli di H2AX erano più alti nelle cellule G1, probabilmente perché la riparazione della DSB è limitata al percorso di giunzione finale non omologa in questa fase del ciclo cellulare.

In linea con il più alto tasso di induzione del DSB e la cinetica di riparazione più lenta, gli ioni di carbonio hanno indotto un arresto del ciclo cellulare più forte e più duraturo nella fase G2 (Figura 3B) e un più alto tasso di apoptosi rispetto ai fotoni (Figura 4C). La radiazione ionica di carbonio può quindi aiutare a superare i meccanismi di radioresistenza osservati nel glioblastoma sulla radioterapia classica con fotoni (vedi Lopez Perez, et al.1 per una discussione dettagliata).

I risultati illustrati nella Figura 4 sono esempi di un risultato ottimale di questo metodo, che mostra chiare differenze tra celle non trattate e irradiate e effetti differenziali statisticamente significativi tra i diversi trattamenti. Nei casi in cui l'induzione di DSB e apoptosi è meno chiara, è importante includere controlli positivi. Come mostrato qui, le cellule fissate 1 h dopo l'irradiazione di fotoni sono buoni controlli positivi per l'induzione di HH2AX. La radiazione fotonica è anche nota per indurre in modo efficiente l'apoptosi nei linfociti, il che li rende utili come controlli positivi per l'apoptosi 2-4 giorni dopo l'irradiazione. Un'altra possibilità è quella di utilizzare farmaci per l'induzione dell'apoptosi, come l'inibitore proteasoso MG132 o un ligando del recettore della morte (Figura 5).

Un altro aspetto importante per un risultato ottimale del test è la qualità dei profili del ciclo cellulare. Nella Figura 4B i picchi G1 e G2 erano stretti e chiaramente separati, rendendo più facile applicare la modellazione del ciclo cellulare e definire le porte per la misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX. A seconda del tipo di cellula e della forza dell'effetto di trattamento (Figura 6A,B), la risoluzione delle diverse fasi del ciclo cellulare può essere significativamente peggiore. In alcuni casi, la concentrazione di DAPI ha un grande impatto sulla qualità del profilo del ciclo cellulare e deve essere regolata (Figura 6C). Nei casi in cui non è rilevabile un picco G1 chiaro a causa del trattamento, lo strumento di modellazione del ciclo cellulare non può essere applicato con precisione. Si consiglia quindi di utilizzare solo gating manuale nel grafico DAPI-A rispetto a DAPI-W basato su controlli con un profilo di ciclo cellulare ben definito, come descritto nel protocollo.

L'analisi di un profilo del ciclo cellulare senza un chiaro picco G1 può essere ulteriormente complicata se il trattamento porta a bassi numeri di cellule che si traducono in grandi cambiamenti nella potenza complessiva del segnale DAPI. In questa situazione, può essere difficile giudicare, se un picco è il G1 o il picco G2. Per evitare questo problema, le cellule possono essere contate con una camera Neubauer o con altri mezzi dopo l'ultima fase di lavaggio (passaggio 3.3) e i numeri di cellulare possono essere regolati. Le posizioni di picco nelle celle trattate corrisponderanno quindi con i controlli.

Figure 1
Figura 1 : impostazione del foglio di lavoro per l'acquisizione del campione. Grafici e cancelli per la visualizzazione del segnale nella finestra Foglio di lavoro del software del citometro di flusso (vedere la Tabella dei materiali). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Strategia di Gating per la valutazione dei dati. Albero della popolazione e diagrammi che mostrano come i cancelli sono impostati per definire le diverse sottopopolazioni nel software di analisi citometrica del flusso. DJF si riferisce allo strumento di modellazione del ciclo cellulare utilizzando il metodo Dean-Jett-Fox25,26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : tabella di esportazione dati non elaborati. Impostazione dell'Editor tabelle per l'esportazione dei dati non elaborati nel software di analisi citometrica del flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : risposta al danno al DNA delle cellule del glioblastoma umano U87 e LN229 dopo l'irradiazione con 4 Gy di fotone e radiazioni ioniche di carbonio. (A) induzione e riparazione DiSB misurate dai livelli di H2AX. L'intensità mediana di fluorescenza è stata normalizzata al contenuto relativo di DNA in ogni fase del ciclo cellulare (G1 - 1,0, S , 1,5, G2 , 2,0) e sono stati sottratti i livelli di controllo. I simboli indicano le barre media e di errore che indicano i valori SD. Le linee continue rappresentano in base alla funzione I(t) : (p1, t2 , p2 t) / (t2 , q1 , t , q2 ) t - 0, p1 < 0, p1, q1, q2 > 0. (B) Distribuzione del ciclo cellulare (media e SD) e istogrammi rappresentativi del marcatore del contenuto del DNA DAPI a 24 ore dopo l'irradiazione di fotoni o ioni di carbonio. (C) Induzione dell'apoptosi, misurata dalle cellule positive caspasi-3 e subG1 (media e SD). P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001 (test t di Student su due lati). Questa cifra è stata modificata da Lopez, etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Induzione da apoptosi mediata da farmaci nelle cellule del glioblastoma U87. Le cellule U87 sono state trattate con 5 ng/mL di un ligando apoptosi modificato correlato al TNF (vedi Tabella deimateriali) più 2,5 MG132 per 20 h prima della fissazione per convalidare la misurazione dell'apoptosi mediante l'analisi attiva della caspase-3 e del subG1. (A) Istogramma del segnale caspase-3 di cellule trattate o non trattate. (B) Istogramma DAPI delle cellule trattate con una popolazione subG1, che indica la degradazione del DNA. L'istogramma degli eventi caspasi-3-positivi è sovrapposto in rosso, dimostrando che la maggior parte delle cellule apoptotiche non aveva ancora degradato il loro DNA in questo momento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : fattori che influenzano la qualità dei profili del ciclo cellulare. Trattamenti troppo duri complicano l'analisi del ciclo cellulare. (A) Nessun picco G1 è rilevabile 48 h dopo il trattamento delle cellule LLC (il carcinoma polmonare di Lewis) con 20 Gy di radiazione fotonica o (B) 96 h dopo il trattamento dei fibrolanti HS68 con 100 mJ di radiazioni UV. (C) Concentrazione DAPI in diverse linee cellulari: nei fibroblasti HS68 (pannello superiore) il picco G2/M (vedi frecce) era ugualmente ben separato dal picco G1 per le concentrazioni di DAPI tra 0,01 e 1,0 g/mL. Al contrario, le concentrazioni di DAPI inferiori a 0,75 g/mL hanno comportato una scarsa separazione e definizione della forma del picco G2/M (vedi frecce) nei fibroblasti MRC-5 (pannello inferiore). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Table 1
Tabella 1: configurazione tipica del citometro a flusso. Lunghezza d'onda del laser di eccitazione, U - tensione del rivelatore, log , scala logaritmica (altrimenti lineare), -A - area del segnale, -H - altezza massima del segnale, -W , larghezza del segnale (durata), FSC , dispersione anteriore, SSC , dispersione laterale. Le specifiche dei filtri ottici sono indicate come lunghezza d'onda/larghezza di banda centrale in nanometri. Le impostazioni possono variare per i diversi ciclimetri di flusso e le tensioni del rivelatore devono essere regolate per diverse linee cellulari.

Figure 1
Figura supplementare Figura 1: Immagini microscopiche dei foci di H2AX. Le cellule U87 sono state irradiate con diverse dosi di radiazioni fotone, fissate e macchiate dopo 30 min secondo il protocollo presentato e preparate per la microscopia come descritto nella discussione. A 2 Gy, i foci individuali potevano essere facilmente distinti, mentre a 8 Gy foci il conteggio era di parte a causa di notevoli sovrapposizioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il metodo in primo piano è facile da usare e offre una misurazione veloce, accurata e riproducibile della risposta al danno del DNA, tra cui l'induzione e la riparazione a doppio filamento (DSB), effetti del ciclo cellulare e morte delle cellule apoptotiche. La combinazione di questi endpoint fornisce un quadro più completo delle loro interrelazioni rispetto ai singoli saggi. Il metodo può essere ampiamente applicato come un test completo sulla genotossicità nei campi della biologia delle radiazioni, della terapia e della protezione, e più in generale in oncologia (ad esempio, per la valutazione del fattore di rischio ambientale, lo screening farmacologico e la valutazione instabilità nelle cellule tumorali).

Il passaggio più critico in questo protocollo è la fissazione delle cellule. Per ottenere un campione pulito con una popolazione cellulare chiaramente definita e una risoluzione ottimale di diverse fasi del ciclo cellulare, è importante dare alle cellule aderenti abbastanza tempo per staccarsi dal vaso di coltura e formare una forma completamente rotonda. Le celle devono essere trasferite nella soluzione di fissaggio come una sospensione a cella singola senza grumi cellulari. Per separarle, le cellule devono essere pipetted su e giù o passato attraverso un ago sottile più volte in casi difficili. Il tempo di fissazione deve essere mantenuto costante tra tutti i campioni e non deve superare i 20 min compreso il tempo per la centrifugazione prima della risospensione delle cellule nel 70% di etanolo. La fissazione prolungata porterà alla perdita di epitopi accessibili per l'associazione degli anticorpi e diminuirà la potenza del segnale e la sensibilità del metodo.

La limitazione principale della tecnica è che non fornisce informazioni sulla qualità dei foci di H2AX diversi dall'intensità in tutto il nucleo. Particolarmente grandi, così come il verificarsi di una colorazione pannucleare, e H2AX, sono stati collegati a DSB raggruppati1,27,28,29, che sono lesioni molto complesse che sono molto difficili per riparare30. Tali lesioni raggruppate sembrano essere caratteristiche per le radiazioni delle particelle come la radiazione agli ioni di carbonio applicata clinicamente e possono essere la ragione per la superiore efficacia biologica della radiazione ionica pesante rispetto ai fotoni31,32 ,33. L'analisi della dimensione del foci di zH2AX può quindi essere interessante come indicatore della complessità del danno. Anche se è possibile utilizzare il protocollo attuale con un citometro a flusso di immagini per visualizzare i foci di H2AX, la risoluzione ottenibile non può competere con un approccio microscopico classico. Tuttavia, abbiamo preparato con successo diapositive microscopiche dai restanti campioni dopo la misurazione citometrica del flusso (supplementare Figura 1) e valutato diverse caratteristiche, tra cui il conteggio dei foci, le dimensioni e l'intensità pannucleare utilizzando un sistema di imaging e analisi semi-automatico. Per preparare i campioni per la microscopia, 30-50 l delle celle colorate sono stati distribuiti sulla superficie di un vetro di copertura 24 mm x 24 mm, aria asciugata durante la notte a temperatura ambiente al buio e poi incorporato con mezzo di montaggio su un vetrino di vetro.

In confronto alla valutazione microscopica dei livelli d'DSB mediante il conteggio dei foci di HS2AX, la misurazione citometrica del flusso è superiore in velocità effettiva, frequenza di campionamento, gamma dinamica e precisione. La gamma dinamica del conteggio microscopico dei foci è limitata dalla risoluzione ottica, portando all'incapacità di distinguere i foci sovrapposti29,34. In pratica, abbiamo osservato una relazione lineare tra la dose di radiazioni e i numeri di foco di H2AX al di sotto di 2 Gy, e un forte effetto di saturazione superiore a 2 Gy nelle cellule glioblastoma U871. Al contrario, l'intensità del segnale H2AX misurata dalla citometria di flusso è aumentata linearmente con la dose per l'intera gamma di dose testata (0-8 Gy).

L'accuratezza del conteggio microscopico dei foci è limitata dall'incapacità di distinguere tra diverse fasi del ciclo cellulare senza macchie aggiuntive35. Il numero di DSB indotti in una cellula non dipende solo dalla dose di radiazioni, ma anche dal contenuto di DNA, e quindi dallo stadio del ciclo cellulare. Le cellule G2, ad esempio, hanno il doppio del DNA delle cellule G1 e il numero medio di DSB indotti a una certa dose di radiazioni è due volte più alto per le cellule G2 rispetto a G1. Ciò si riflette chiaramente nell'intensità del segnale Di H2AX rispetto ai globuli G1 nei primi punti dopo la radiazione misurata dalla citometria di flusso. Pertanto, è importante valutare i livelli DSB in modo specifico del ciclo cellulare per ottenere risultati accurati. Un'analisi congiunta delle cellule in diverse fasi del ciclo cellulare, come al solito negli approcci microscopici, può essere distorta dagli spostamenti nella distribuzione del ciclo cellulare, in particolare a causa dell'arresto di G2 indotto dalle radiazioni. Per tenere conto di questo effetto e confrontare le caratteristiche di riparazione DSB tra i diversi stadi del ciclo cellulare, i livelli di SH2AX possono essere facilmente normalizzati al contenuto del DNA nel metodo della citometria di flusso, come indicato nel protocollo.

Le estensioni del protocollo attuale sono possibili con relativamente poco sforzo supplementare. Ulteriori anticorpi con etichette fluoroforicompatibili compatibili possono essere inclusi nel passaggio 3.4 senza la necessità di ulteriori passaggi durante la preparazione del campione. Se si desidera un'analisi più dettagliata dell'apoptosi, si potrebbero includere gli anticorpi caspasi-7, -9 e -8. Come un'altra estensione, abbiamo recentemente incluso un colorante cellulare vivo e morto, un anticorpo T troponina e perline di conteggio nel protocollo per analizzare specificamente i cardiomiociti co-coltivati con fibroblasti dopo l'irradiazione. L'aggiunta della macchia cellulare viva/morta e le perline di conteggio amplialano la capacità del metodo di includere la proliferazione fibroblasta e la morte cellulare non apoptotica dei cardiomiociti come ulteriori endpoint che forniscono utili informazioni aggiuntive sulla cellula destino dopo lo stress genotossico. Il protocollo esteso è disponibile su richiesta.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il team di Flow Cytometry Facility presso il German Cancer Research Center (DKF) per il loro supporto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL filter tips Nerbe plus 07-693-8300
100-1,000 µL pipette Eppendorf 3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size BD Falcon 352235
15 mL tubes BD Falcon 352096
200 µL filter tips Nerbe plus 07-662-8300
20-200 µL pipette Eppendorf 3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 BioLegend 613406 Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 BD Pharmingen 560626 Dilute 1:20
BD FACSClean solution BD Biosciences 340345 For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solution BD Biosciences 340346 For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Biochrom L 182 Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin Biochrom FG 0415 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absolute VWR 20821.330
Excel software Microsoft
FBS Superior (fetal bovine serum) Biochrom S 0615 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 software LLC online order
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hw NeoLab 11416
LSRII or LSRFortessa cytometer BD Biosciences
MG132 Calbiochem 474787 optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+ Heraeus
Paraformaldehyde AppliChem A3813 Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 Cell Signaling Technology #3475 Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2 Integra Biosciences 155 016
Serological pipettes, 10 mL Corning 4488
Serological pipettes, 25 mL Corning 4489
Serological pipettes, 5 mL Corning 4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) Biomol AG-40T-0002-C020 optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasks Greiner bio-one 690160 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-025500 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cells ATCC ATCC-HTB-14 Example cell line used in the protocol

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References

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