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Cancer Research

Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/59968
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1CCU Molecular and Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 2Department of Radiation Oncology, Heidelberg University Hospital, 3Department of Radiation Oncology, Freiburg University Medical Center

Summary

El método presentado combina el análisis cuantitativo de las roturas de doble cadena de ADN (DSB), la distribución del ciclo celular y la apoptosis para permitir la evaluación específica del ciclo celular del Dsb de inducción y la reparación, así como las consecuencias de la falla de reparación.

Abstract

El método presentado o versiones ligeramente modificadas han sido ideados para estudiar las respuestas específicas del tratamiento y los efectos secundarios de varios tratamientos contra el cáncer como se utiliza en la oncología clínica. Permite un análisis cuantitativo y longitudinal de la respuesta del daño del ADN después del estrés genotóxico, inducido por la radioterapia y una multitud de fármacos contra el cáncer. El método cubre todas las etapas de la respuesta al daño del ADN, proporcionando puntos finales para la inducción y reparación de roturas de doble cadena de ADN (DSB), detención del ciclo celular y muerte celular por apoptosis en caso de falla de reparación. La combinación de estas mediciones proporciona información sobre los efectos del tratamiento dependientedel del ciclo celular y, por lo tanto, permite un estudio en profundidad de la interacción entre la proliferación celular y los mecanismos de afrontamiento contra el daño del ADN. Dado que el efecto de muchas terapias oncológicas, incluidos los agentes quimioterápicos y la radiación ionizante, varía o varía considerablemente según las fases específicas del ciclo celular, los análisis correlativos se basan en un método robusto y factible para evaluar los efectos del tratamiento en el ADN de una manera específica del ciclo celular. Esto no es posible con ensayos de un solo punto y una ventaja importante del método presentado. El método no se limita a ninguna línea celular en particular y se ha probado a fondo en una multitud de líneas celulares tumorales y de tejido normal. Se puede aplicar ampliamente como un ensayo integral de genotoxicidad en muchos campos de la oncología además de la radiooncología, incluida la evaluación de factores de riesgo ambientales, la detección de fármacos y la evaluación de la inestabilidad genética en las células tumorales.

Introduction

El objetivo de la oncología es matar o desactivar las células cancerosas sin dañar las células normales. Muchas terapias inducen directa o indirectamente estrés genotóxico en las células cancerosas, pero también a cierta extensión en las células normales. La quimioterapia o los medicamentos dirigidos a menudo se combinan con radioterapia para mejorar la radicalidad del tumor irradiado1,2,3,4,5, lo que permite una reducción de la dosis de radiación para minimizar el daño normal del tejido.

La radiación ionizante y otros agentes genotóxicos inducen diferentes tipos de daño en el ADN, incluidas modificaciones en la base, retituladores de hebras y roturas de una o dos hilos. Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) son las lesiones de ADN más graves y su inducción es clave para el efecto mortal celular de la radiación ionizante y varios fármacos citostáticos en la radioterapia. Los DSB no sólo dañan la integridad del genoma, sino que también promueven la formación de mutaciones6,7. Por lo tanto, diferentes vías de reparación dsb, y mecanismos para eliminar las células irreparablemente dañadas como la apoptosis se han desarrollado durante la evolución. Toda la respuesta de daño al ADN (DDR) está regulada por una compleja red de vías de señalización que se extiendendesde el reconocimiento de daños del ADN y la detención del ciclo celular para permitir la reparación del ADN, hasta la muerte celular programada o la inactivación en caso de fallo de reparación 8.

El método citométrico de flujo presentado se ha desarrollado para investigar la DDR después de la tensión genotóxica en un ensayo exhaustivo que cubre la inducción y reparación del DSB, así como las consecuencias de la falla de reparación. Combina la medición del marcador DSB-H2AX ampliamente aplicado con el análisis del ciclo celular y la inducción de la apoptosis, utilizando el análisis subG1 clásico y la evaluación más específica de la activación de la caspasa-3.

La combinación de estos puntos finales en un ensayo no solo reduce los gastos de tiempo, mano de obra y costos, sino que también permite la medición específica del ciclo celular de la inducción y reparación del DSB, así como la activación de la caspasa-3. Estos análisis no serían posibles con ensayos realizados de forma independiente, pero son muy relevantes para una comprensión integral de la respuesta del daño del ADN después del estrés genotóxico. Muchos medicamentos contra el cáncer, como los compuestos citostáticos, se dirigen contra las células divisorias y su eficiencia depende en gran medida de la etapa del ciclo celular. La disponibilidad de diferentes procesos de reparación del Dsb también depende de la etapa del ciclo celular yde la elección de la vía, que es fundamental para la precisión de la reparación, y a su vez determina el destino de la celda 9,10,11, 12. Además, la medición específica del ciclo celular de los niveles de OSD es más precisa que el análisis agrupado, ya que los niveles de OSD no sólo dependen de la dosis de un compuesto genotóxico o radiación, sino también del contenido de ADN de la célula.

El método se ha utilizado para comparar la eficacia de diferentes radioterapias para superar los mecanismos de resistencia en el glioblastoma13 y para diseccionar la interacción entre la radiación ionizante y los fármacos dirigidos en el osteosarcoma14,15 y cánceres de rabdoide teratoide atípico16. Además, el método descrito se ha utilizado ampliamente para analizar los efectos secundarios de la radio y la quimioterapia en las células madre mesenquimales17,18,19,20,21, 22,23,24, que son esenciales para la reparación del daño tisular normal inducido por el tratamiento y tienen una posible aplicación en la medicina regenerativa.

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Protocol

1. Preparación

  1. Preparar 1 x 105 células/muestra en cualquier tipo de recipiente de cultivo como material de partida.
    1. Por ejemplo, lleve a cabo un experimento de curso de tiempo después de la exposición de las células del glioblastoma U87 a la radiación ionizante: Irradiar células Subconfluentes U87 en matraces T25 en triplicados para cada punto de tiempo. Elija los primeros puntos de tiempo (15 min hasta 8 h después de la irradiación) para seguir la cinética de la reparación dsb (nivel de H2AX) y los puntos de tiempo tardíos (24 h hasta 96 h) para evaluar los niveles residuales del Dsb, los efectos del ciclo celular y la apoptosis.
      NOTA: El protocolo no se limita a experimentos de irradiación ni a ninguna línea celular específica. Se ha probado con numerosas líneas celulares de todo tipo, de diferentes especies y para diversas condiciones de tratamiento.
  2. Prepare las siguientes soluciones, incluyendo un 10% de exceso de volumen.
    1. Preparar 2 ml por muestra de solución de fijación compuesta de 4,5% de paraformaldehído (PFA) en solución salina con fosfato tampón (PBS). Prepare la solución fresca. Diluir el PFA en PBS calentando a 80 oC con agitación lenta bajo la campana de humo. Cubra el matraz con papel de aluminio para evitar la pérdida de calor. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y ajuste el volumen final. Pase la solución a través de un filtro de celulosa plegado, grado 3hw (ver la Tabla de Materiales).
      PRECAUCION: Los humos de pfA son tóxicos. Realice este paso bajo una campana de humo y deseche los residuos de PFA adecuadamente.
    2. Preparar 3 ml por muestra de solución de permeabilización compuesta de 70% de etanol en hielo-frío H2O. Almacenar a -20 oC.
    3. Preparar 7 ml por muestra de solución de lavado compuesta por 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS.
    4. Preparar 100 ml por muestra de 3% de BSA en PBS como diluyente de anticuerpos.
    5. Preparar 100-250 l por muestra de solución de tinción de ADN compuesta por 1 g/ml 4',6-diamidina-2-fenilindol (DAPI) en PBS.
  3. Ajuste la centrífuga para tubos de 15 ml a 5 min a 200 x g y 7 oC. Deje que la centrífuga se enfríe y use estos ajustes para todos los pasos de centrifugación.

2. Recogida de muestras

  1. Si procesa células adherentes (p. ej., células de glioblastoma U87 cultivadas en matraces T25 con 5 ml del medio eagle modificado de Dulbecco complementado con un 10% de suero bovino fetal a 37 oC y un 5% de atmósfera de dióxido de carbono), continúe con los pasos 2.1.1. y 2.1.2. Para las células de suspensión proceda directamente al paso 2.1.2.
    1. Recoger el medio en un tubo de centrifugación. Separar las células utilizando un método de cultivo celular de rutina, que puede incluir el uso de trippsina, ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) u otros agentes de desprendimiento celular.
      1. Para las células U87, precalentar PBS y trippsin/EDTA (ver la Tabla de Materiales)a 37oC, lavar la capa celular con 1 ml de PBS, incubar las células durante 1-2 min con 1 ml de trippsina/EDTA y apoyar el desprendimiento de células tocando en el matraz. Recoger toda la solución de lavado y la suspensión celular en el tubo con el medio.
    2. Centrifugar las células, desechar el medio y resuspender las células en 1 ml de PBS.
  2. Pipetee las células hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurar una suspensión de una sola célula y transfiera la suspensión celular en un tubo con 2 ml de solución de fijación (4,5% PFA/PBS, 3% de concentración final).
    PRECAUCION: Los humos de pfA son tóxicos. Realice este paso bajo una campana de humo y deseche los residuos de PFA adecuadamente.
  3. Incubar las células durante 10 min a temperatura ambiente.
  4. Centrifugar las células y desechar el sobrenadante por decantación.
  5. Afloje el pellet celular tocando en el tubo y resuspenda las células en 3 ml de etanol al 70%. Proceda directamente con el siguiente paso o almacene las muestras a 4 oC durante un máximo de varias semanas.

3. Lavado y tinción

  1. Centrifugar las células y desechar el sobrenadante por decantación.
  2. Afloje el pellet celular tocando en el tubo. Resuspender las células en 3 ml de solución de lavado (0,5% BSA/PBS), centrífuga y deseche el sobrenadante.
  3. Repita el paso de lavado 1x con 3 ml y, a continuación, 1x con 1 ml de solución de lavado. En el último paso, deseche el sobrenadante cuidadosamente pipeteando. Tenga cuidado de no aspirar el pellet.
  4. Diluir los anticuerpos contra el H2AX, el fosfo-histona H3 (Ser10) y la caspasa-3 (véase la Tabla de Materiales)en 100 l/muestra con diluyente de anticuerpos (3% de BSA/PBS).
  5. Afloje el gránulo celular tocando en el tubo y resuspenda las células en 100 s de la solución de anticuerpos preparada en el paso 3.4. Mantenga las muestras en la oscuridad a partir de este paso.
  6. Incubar las muestras durante 1 h a temperatura ambiente.
  7. Centrifugar las células y desechar el sobrenadante cuidadosamente pipeteando. Tenga cuidado de no aspirar el pellet.
  8. Afloje el gránulo celular tocando en el tubo y resuspenda las células en 100-250 l de solución de tinción de ADN (1 g/ml DAPI/PBS).
    1. Utilice 100 l si hay 1-2 x105 celdas presentes y aumente el volumen para números de celda más altos (250 l para 1 x 106 celdas). Proceda directamente con el siguiente paso o almacene las muestras en la oscuridad a 4 oC durante un máximo de 2 semanas.
      NOTA: Para algunos tipos de células optimizar la concentración de DAPI puede ayudar a mejorar la separación de las fases del ciclo celular.
  9. Pipet las muestras a través de la tapa del colador de la célula de un tubo de muestra con un tamaño de poro de malla de 35 m.

4. Medición

  1. Coloque las muestras sobre hielo, inicie el citómetro de flujo (consulte la Tabla de materiales)configurado con una configuración óptica de acuerdo con la Tabla 1 y pulse el botón Prime. Si es necesario, encienda el láser ultravioleta (longitud de onda de 355 nm) por separado y ajuste la potencia a 10 mW utilizando el software adecuado.
  2. Abra el software de adquisición (consulte Tabla de materiales), inicie sesión y cree un nuevo experimento haciendo clic en el botón Nuevo experimento de la barra de herramientas del navegador.
  3. Utilice la ventana Inspector para personalizar el nombre del experimento y elija '5 Log Decades' para la visualización del trazado.
  4. Haga clic en el botón Nuevo espécimen en la barra de herramientas del navegador y expanda la nueva entrada haciendo clic en el símbolo '+' en su lado izquierdo para mostrar el primer tubo. Seleccione el icono y escriba el icono correspondiente para cambiar el nombre de la muestra (por ejemplo, el tipo de celda) y el tubo (identificador de muestra). Haga clic en el puntero de tubo del primer tubo (símbolo de flecha a su izquierda) para volverlo verde (activo).
  5. Abra la pestaña Parámetros en la ventana del citómetro y elija los parámetros según la Tabla 1. Elimine todos los parámetros innecesarios.
    NOTA: los nombres de los parámetros pueden variar en función de los ajustes preestablecidos personalizados (por ejemplo, Cy3 en lugar de Alexa555). Asegúrese de que la selección coincida con los filtros ópticos y detectores de la Tabla1. Las trayectorias de luz de todos los fluoróforos son totalmente independientes en esta configuración y no se requiere compensación de superposición espectral; sin embargo, podría ser necesario si se utiliza otra configuración óptica.
  6. Abra la ventana Hoja de trabajo y cree trazados de acuerdo con la Figura1. Dibuje 2 trazados de puntos y 4 histogramas utilizando los botones de la barra de herramientas correspondientes y haga clic en las etiquetas del eje para elegir los parámetros apropiados (dispersión frontal (FSC-A) frente a dispersión lateral (SSC-A), DAPI-W frente a DAPI-A y un histograma para DAPI-A y cada anticuerpo acoplado Fluoróforo.
  7. Conecte una muestra de control al citómetro y pulse el botón Ejecutar del instrumento. Seleccione el primer tubo en la ventana Navegador del software y haga clic en el botón Adquirir datos en el Panel de adquisición. Ajuste el volumen de inyección de muestra utilizando los botones Bajo, Medio o Alto y la rueda de afinación fina del instrumento. Preferiblemente trabajar en la configuración baja, pero tratar de adquirir al menos 100 eventos/segundo (consulte Panel de adquisición).
  8. Ajuste los voltajes del detector para FSC, SSC y DAPI en la pestaña Parámetros de la ventana Inspector utilizando las gráficas de puntos de la Figura 1 como guía. Cambie a la escala logarítmica para los parámetros FSC y SSC si la población celular aparece demasiado dispersa en una escala lineal.
  9. Presione el botón Standby en el citómetro y continúe con la configuración de la hoja de trabajo en el software.
    1. Utilice la herramienta Puerta de polígono para definir la población de celdas en el trazado FSC-A frente a SSC-A y la herramienta Puerta rectangular para definir la población de Celdas Individuales en la gráfica DAPI-W frente a DAPI-A. Presione Ctrl + G teclas para mostrar la jerarquía de población y haga clic en los nombres de puerta predeterminados para cambiarles el nombre.
    2. Posteriormente, haga clic con el botón derecho en todos los histogramas y elija Mostrar poblaciones . SingleCells desde el menú contextual.
  10. Optimice los voltajes del detector para los fluoróforos acoplados a anticuerpos para cubrir todo el rango dinámico adquiriendo posteriormente muestras de control y tratadas. Maximice la relación señal-ruido y evite la saturación del detector. Asegúrese de que el pico Alexa488 de la población SingleCells no se trunca en el control ni en la muestra tratada.
  11. Pulse el botón Standby en el citómetro y, opcionalmente, realice los pasos 4.11.1-4.11.3 en la ventana Hoja de trabajo del software para obtener una estimación aproximada de los efectos del tratamiento durante la adquisición de la muestra.
    1. Seleccione SingleCells en la jerarquía de población y utilice la herramienta Puerta rectangular para definir la población G1 en el trazado DAPI-W frente a DAPI-A. Haga clic con el botón derecho del botón derecho en el histograma Alexa488 y elija Mostrar poblaciones . G1 del menú contextual.
    2. Haga clic con el botón derecho en el histograma Alexa488 y elija Crear vista de estadísticas en el menú contextual. Haga clic con el botón derecho en la vista Estadísticas y elija Editar vista de estadísticas. Vaya a la pestaña Estadísticas y active la casilla de verificación para la mediana de la señal Alexa488 en la población G1 (desactive todas las demás opciones).
    3. Seleccione SingleCells en la jerarquía de población y utilice la herramienta Intervalo de distancia para definir las poblaciones subG1, M y Casp3+ en dAPI-A, Alexa555-A (Cy3-A en la figura1) y Histogramas Alexa647-A.
  12. Pulse el botón Ejecutar del citómetro y mida las muestras utilizando el Panel de adquisición del software. Establezca la puerta de detención en Todos los eventos o la puerta De celdas (si hay numerosas partículas pequeñas) y el número de eventos que se registrarán en 10.000.
  13. Haga clic en Siguiente tubo para crear una nueva muestra, cámbiele el nombre en la ventana Navegador, haga clic en Adquirir datos para iniciar la adquisición y Registre datos para iniciar la grabación.
  14. Seleccione Archivo (File) ) Exportar ? Experimenta en la barra de menús y elige Exportación de directorios en el cuadro de diálogo para guardar los datos como archivos '.fcs'. Opcionalmente, guarde el experimento como un archivo zip adicional si desea volver a importar el experimento en un momento posterior.
    NOTA: La configuración de los experimentos existentes se puede reutilizar fácilmente con Editar . Duplicar sin datos.

5. Evaluación de datos

  1. Arrastre y suelte los archivos '.fcs' en el navegador de muestras del software de análisis citométrico de flujo (consulte Tabla de materiales). Aplique la estrategia de gating que se muestra en la Figura2. Asegúrese de que las puertas se ajustan a la población correspondiente en todas las muestras antes de proceder con la siguiente puerta hija.
    1. Para aplicar cambios a todas las muestras, seleccione la puerta modificada en el navegador de muestras, cópiela presionando Ctrl + C, seleccione la puerta principal, presione Ctrl + Mayús + E para seleccionar los nodos equivalentes en todas las muestras y presione Ctrl + V para pegar o sobrescribir la puerta. No utilice puertas de grupo.
    2. Haga doble clic en la primera muestra del navegador para abrir la gráfica SSC-A frente a FSC-A. Utilice la herramienta Polígono de la barra de herramientas para definir la población de celdas (Figura2, trazado 1), excluyendo los residuos del análisis. Asegúrese de que la puerta es lo suficientemente ancha hacia la esquina superior derecha para acomodar los turnos relacionados con el tratamiento, pero restrinja el borde hacia la esquina inferior izquierda de la parcela para excluir de forma fiable la celda.
    3. Haga doble clic en la puerta Celdas para abrir una nueva ventana de trazado y cambie los ejes a DAPI-W (vertical) frente a DAPI-A (horizontal) haciendo clic en las etiquetas del eje. Utilice la herramienta Rectángulo para definir la población de SingleCells (Figura2, gráfica 2), excluyendo los dobletes de celda o grupos del análisis (los dobletes de celdas G1 tienen la misma intensidad DAPI-A que las celdas G2 y M, pero un DAPI-W considerablemente mayor valor).
      NOTA: Variar el recuento de células en diferentes muestras causará cambios en la intensidad general de la señal DAPI-A debido a la unión de equilibrio de DAPI al ADN. Esto no afectará el análisis del ciclo celular, pero puede ser necesario ajustar el borde derecho de la muestra de puerta de celda única por muestra para tener en cuenta estos turnos.
    4. Haga doble clic en la puerta SingleCells para abrir una nueva ventana de trazado y cambiar los ejes para mostrar el histograma DAPI-A. Utilice la herramienta Bisector para distinguir células individuales con contenido normal de ADN (poblaciónde CellCycle) de células apoptoticas con ADN degradado (poblaciónsubG1). Posteriormente seleccione las nuevas puertas en el navegador y presione Ctrl + R para cambiarles el nombre en consecuencia (Figura2, trazado 3).
    5. Seleccione la puerta de CellCycle en el navegador y elija Herramienta . Biología Ciclo celular... desde la barra de menús para abrir la herramienta de modelado de ciclo de celda. Elija Dean-Jett-Fox25,26 en la sección Modelo para estimar la frecuencia de las celdas en las fases G1, S y G2/M (Figura2,gráfica 4). Utilice restricciones solo en caso de un rendimiento de modelado deficiente (minimice la desviación del cuadrado medio raíz entre el modelo y los datos).
    6. Crear puertas para G1 (herramientaElipse), S (herramientaPolígono) y G2 + M (herramientaElipse) fase en la gráfica DAPI-W vs DAPI-A de la población CellCycle para habilitar la medición específica del ciclo de celdas ( Figura 2, parcela 5). No utilice la herramienta de modelado para el ciclo de celdas automático basado en el histograma DAPI-A, ya que esto puede ser inexacto.
      NOTA: Puede ser necesario mover las puertas a lo largo de la muestra del eje DAPI-A por muestra para tener en cuenta los cambios antes mencionados en la intensidad general de la señal DAPI. Sólo mover las tres puertas como un grupo y no cambiar la forma de puertas individuales para evitar el sesgo.
    7. Utilice la herramienta Bisector para distinguir las celdas fosfo-histona H3 positivo(M) y -negativo(M-) en el histograma Alexa555-A de la población CellCycle (Figura2,parcela 6). Mantenga pulsada la tecla Ctrl y seleccione las puertas G2 + M y M-. Presione Ctrl + Mayús + A para crear la puerta G2 (G2+M y M-).
    8. Utilice la herramienta Bisector para distinguir las células caspasa-3-positivas (Casp3+) y -negativo (Casp3-) en el histograma Alexa647-A de la población SingleCells (Figura2, gráfica 7). Establezca el umbral de tal manera que el promedio de la población Casp3+ en los controles no tratados sea de 0,8% para asegurar una alta sensibilidad y minimizar las variaciones de ensayo a ensayo.
    9. Presione Ctrl + T para abrir el Editor de tablas y configurarlo de acuerdo con la Figura 3. Arrastre y suelte las diferentes poblaciones del explorador de ejemplo en el Editor de tablas y haga doble clic en las filas para cambiar la configuración de estadísticas, parámetros y nombres. Elimine las filas innecesarias que se agregan automáticamente después de arrastrar y soltar el icono de modelado del ciclo de celda seleccionando las filas y presionando Del.
    10. Elija Para archivo, el formato y el destino en la sección Salida de la cinta de opciones del menú y haga clic en Crear tabla para exportar los datos como archivo '.xlsx'.
  2. Utilice el software de cálculo de tablas (consulte Tabla de materiales) para un análisis de datos adicional según el archivo suplementario 1 (FACS_Analysis_Template_(1).xlsx).
    1. Corrija las frecuencias de las células en las diferentes fases del ciclo celular de tal manera que su suma sea del 100% aplicando la fórmula X' x X * 100 / o (todas las fases del ciclo de celda), con X': valor corregido, X: valor bruto, a cada fase del ciclo de celda.
      NOTA: Las desviaciones de una suma del 100% ocurren debido a imprecisiones en el modelado del ciclo celular, pero por lo general son pequeñas (<5%).
    2. Normalizar las intensidades medias de H2AX al contenido de ADN en las diferentes fases del ciclo celular dividiendo los valores en la fase S por 1.5 y en la fase G2 y M por 2.0.
    3. Para calcular el nivel normalizado combinado de H2AX en toda la población celular, utilice la fórmula IA - IG1 * G1 + IS * S + IG2 * G2 + IM * M, donde IA, IG1,I S, IG2, IM son las intensidades medias normalizadas de h2AX de todos, G1, S, G2, células M respectivamente y G1, S, G2, M se corrigen la frecuencia de las células en la fase de ciclo celular respectiva.
    4. Para los niveles normalizados de H2AX y la frecuencia de las células subG1 y caspasa-3 positivas, reste el valor medio de los controles no tratados de cada muestra.
    5. Calcule la media y la desviación estándar de cada parámetro de todas las muestras de réplica y trace los resultados en diagramas.

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Representative Results

Las células humanas del glioblastoma U87 o LN229 fueron irradiadas con 4 Gy de radiación de fotón o iones de carbono. Los niveles específicos del ciclo celular de H2AX y la apoptosis se midieron en diferentes puntos de tiempo hasta 48 h después de la irradiación utilizando el método citométrico de flujo presentado aquí (Figura3). En ambas líneas celulares, los iones de carbono indujeron niveles máximos más altos de H2AX que disminuyeron más lentamente y se mantuvieron significativamente elevados a 24 a 48 h en comparación con la radiación de fotones a la misma dosis física (Figura4A). Esto indicaba que los iones de carbono indujeron niveles máximos más altos de roturas de doble cadena de ADN (DSB) que los fotones que fueron reparados de manera menos eficiente. Para ambos tipos de radiación, los niveles de H2AX fueron más altos en las células G1, probablemente porque la reparación del DSB se limita a la vía de unión final no homóloga en esta etapa del ciclo celular.

En consonancia con la mayor tasa de inducción del OSD y la cinética de reparación más lenta, los iones de carbono indujeron una detención del ciclo celular más fuerte y duradera en la fase G2 (Figura3B) y una tasa más alta de apoptosis que los fotones (Figura4C). Por lo tanto, la radiación iónica de carbono puede ayudar a superar los mecanismos de radiorresistencia observados en el glioblastoma sobre la radioterapia clásica con fotones (véase Lopez Perez, et al.1 para una discusión detallada).

Los resultados mostrados en la Figura 4 son ejemplos de un resultado óptimo de este método, mostrando claras diferencias entre las células no tratadas e irradiadas y efectos diferenciales estadísticamente significativos entre diferentes tratamientos. En los casos en que la inducción de DSB y apoptosis es menos clara, es importante incluir controles positivos. Como se muestra aquí, las células fijas 1 h después de la irradiación de fotones son buenos controles positivos para la inducción de H2AX. La radiación fotón también es conocida por inducir eficientemente la apoptosis en los linfocitos, lo que los hace útiles como controles positivos para la apoptosis 2-4 días después de la irradiación. Otra posibilidad es utilizar medicamentos para la inducción de la apoptosis, como el inhibidor del proteasoma MG132 o un ligando del receptor de la muerte (Figura5).

Otro aspecto importante para un resultado óptimo del ensayo es la calidad de los perfiles del ciclo celular. En la Figura 4B, los picos G1 y G2 estaban estrechos y claramente separados, lo que facilitaba la aplicación del modelado del ciclo celular y la definición de las puertas para la medición específica del ciclo celular de H2AX. Dependiendo del tipo de célula y la fuerza del efecto de tratamiento (Figura6A,B),la resolución de las diferentes fases del ciclo celular puede ser significativamente peor. En algunos casos, la concentración de DAPI tiene un gran impacto en la calidad del perfil del ciclo celular y debe ajustarse (Figura6C). En los casos en que no se puede detectar un pico G1 claro debido al tratamiento, la herramienta de modelado del ciclo celular no se puede aplicar con precisión. Es aconsejable utilizar únicamente el gating manual en la gráfica DAPI-A frente a DAPI-W basada en controles con un perfil de ciclo celular bien definido, como se describe en el protocolo.

El análisis de un perfil de ciclo celular sin un pico G1 claro puede ser más complicado si el tratamiento conduce a números celulares bajos que resultan en grandes cambios en la intensidad general de la señal DAPI. En esta situación, puede ser difícil de juzgar, si un pico es el Pico G1 o el Pico G2. Para evitar este problema, las células se pueden contar con una cámara Neubauer o por otros medios después del último paso de lavado (paso 3.3) y los números de celda se pueden ajustar. Las posiciones máximas en las celdas tratadas coincidirán con los controles.

Figure 1
Figura 1 : Configuración de la hoja de trabajo para la adquisición de muestras. Trazados y puertas para la visualización de la señal en la ventana Hoja de trabajo del software del citómetro de flujo (consulte la Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Estrategia de ampliación para la evaluación de datos. El árbol de población y los diagramas que muestran cómo se establecen las puertas para definir las diferentes subpoblaciones en el software de análisis citométrico de flujo. DJF se refiere a la herramienta de modelado de ciclo celular utilizando el método Dean-Jett-Fox25,26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Tabla de exportación de datos sin procesar. Configuración del 'Editor de tablas' para la exportación de datos sin procesar en el software de análisis citométrico de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Respuesta de daño al ADN de las células humanas de glioblastoma U87 y LN229 después de la irradiación con 4 Gy de fotones frente a radiación iónica de carbono. (A) inducción y reparación del OSD medida por los niveles de H2AX. La intensidad media de la fluorescencia se normalizó al contenido relativo de ADN en cada fase del ciclo celular (G1 a 1,0, S a 1,5, G2 a 2,0) y se restaban los niveles de control. Los símbolos indican la media y las barras de error indican valores SD. Las líneas sólidas representan los ajustes de acuerdo con la función I(t) á (p1*t2 + p2*t) / (t2 + q1*t + q2) t á 0, p1 < 0, p1, q1, q2 > 0. (B) Distribución del ciclo celular (media y SD) e histogramas representativos del marcador de contenido de ADN DAPI a las 24 h después de la irradiación de fotón o iones de carbono. (C) Inducción de apoptosis, medida por células positivas de caspasa-3 y subG1 (media y SD). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (prueba t de dos lados del estudiante). Esta cifra ha sido modificada de López, et al.1 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Inducción de apoptosis mediada por fármacos en células de glioblastoma U87. Las células U87 fueron tratadas con 5 ng/ml de un ligando inductor de apoptosis TNF modificado (ver Tabla de Materiales)más 2.5 M MG132 para 20 h antes de la fijación para validar la medición de la apoptosis mediante el análisis activo de caspasa-3 y subG1. (A) Histograma de la señal de caspasa-3 de células tratadas frente a células no tratadas. (B) histograma DAPI de células tratadas con una población subG1, lo que indica la degradación del ADN. El histograma de eventos positivos de caspasa-3 está superpuesto en rojo, lo que demuestra que la mayoría de las células apoptoticas aún no habían degradado su ADN en este momento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Factores que influyen en la calidad de los perfiles del ciclo celular. Los tratamientos demasiado duros complican el análisis del ciclo celular. (A) No hay pico G1 es detectable 48 h después del tratamiento de células LLC (carcinoma pulmonar de Lewis) con 20 gy de radiación fotón o (B) 96 h después del tratamiento de fibroblastos HS68 con 100 mJ de radiación UV. (C) concentración de DAPI en diferentes líneas celulares: En los fibroblastos HS68 (panel superior) el pico G2/M (ver flechas) estaba igualmente bien separado del pico G1 para las concentraciones de DAPI entre 0,01 y 1,0 g/ml. Por el contrario, las concentraciones de DAPI inferiores a 0,75 g/ml dieron lugar a una separación deficiente y a una definición de forma del pico G2/M (ver flechas) en los fibroblastos MRC-5 (panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: Configuración típica del catómetro de flujo. • Longitud de onda del láser de excitación, U - voltaje del detector, registro - escala logarítmica (de lo contrario lineal), -A - área de señal, -H - altura máxima de la señal, -W - anchura de la señal (duración), FSC - dispersión frontal, SSC - dispersión lateral. Las especificaciones del filtro óptico se indican como longitud de onda/ancho de banda central en nanómetros. Los ajustes pueden variar para diferentes citometros de flujo y los voltajes del detector deben ajustarse para diferentes líneas celulares.

Figure 1
Figura suplementaria 1: Imágenes microscópicas de focos de la H2AX. Las células U87 fueron irradiadas con diferentes dosis de radiación fotóna, fijas y teñidas después de 30 minutos según el protocolo presentado y preparadas para la microscopía como se describe en la discusión. A 2 Gy, los focos individuales podían distinguirse fácilmente, mientras que en 8 Gy foci contabilera estaba sesgado debido a una considerable superposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El método destacado es fácil de usar y ofrece una medición rápida, precisa y reproducible de la respuesta de daño del ADN, incluyendo la inducción y reparación de rotura de doble cadena (DSB), efectos del ciclo celular y muerte celular apoptótica. La combinación de estos puntos finales proporciona una imagen más completa de sus interrelaciones que los ensayos individuales. El método puede aplicarse ampliamente como un ensayo integral de genotoxicidad en los campos de la biología de la radiación, la terapia y la protección, y más generalmente en oncología (por ejemplo, para la evaluación de factores de riesgo ambientales, el cribado de fármacos y la evaluación de inestabilidad en las células tumorales).

El paso más crítico en este protocolo es la fijación de las células. Para obtener una muestra limpia con una población celular claramente definida y una resolución óptima de diferentes fases del ciclo celular, es importante dar a las células adherentes tiempo suficiente para separarse del recipiente de cultivo y formar una forma completamente redonda. Las células deben transferirse a la solución de fijación como una suspensión de una sola célula sin grumos celulares. Para separarlas, las células deben ser pipetadas hacia arriba y hacia abajo o pasadas a través de una aguja fina varias veces en casos difíciles. El tiempo de fijación debe mantenerse constante entre todas las muestras y no debe exceder de 20 minutos, incluido el tiempo de centrifugación antes de la resuspensión de las células en 70% etanol. La fijación prolongada conducirá a la pérdida de epítopos accesibles para la unión de anticuerpos y disminuirá la fuerza de la señal y la sensibilidad del método.

La principal limitación de la técnica es que no proporciona información sobre la calidad de los focos de la H2AX que no sea la intensidad en todo el núcleo. En particular, los grandes focos de la H2AX, así como la aparición de una tinción pannuclear-H2AX se han relacionado con los BBe agrupados1,27,28,29, que son lesiones muy complejas que son muy difíciles para reparar30. Estas lesiones agrupadas parecen ser características de la radiación de partículas, como la radiación de iones de carbono aplicada clínicamente, y pueden ser la razón de la eficacia biológica superior de la radiación iónica pesada en comparación con los fotones31,32 ,33. Por lo tanto, el análisis del tamaño de los focos de la H2AX puede ser de interés como un indicador de la complejidad del daño. Aunque es posible utilizar el protocolo actual con un citómetro de flujo de imagen para visualizar los focos de la h2AX, la resolución alcanzable no puede competir con un enfoque microscópico clásico. Sin embargo, hemos preparado con éxito diapositivas microscópicas de las muestras restantes después de la medición citométrica de flujo (Figurasuplementaria 1) y hemos evaluado varias características, incluyendo el recuento de focos de H2AX, el tamaño y la intensidad pannuclear utilizando un sistema semiautomatizado de imágenes y análisis. Para preparar las muestras para la microscopía, 30-50 l de las células teñidas se extendieron sobre la superficie de un vidrio de cubierta de 24 mm x 24 mm, se secó al aire durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad y luego se incrustaron con medio de montaje en un portaobjetos de vidrio.

En comparación con la evaluación microscópica de los niveles de Dsb mediante el recuento de focos de H2AX, la medición citométrica de flujo es superior en rendimiento, frecuencia de muestreo, rango dinámico y precisión. El rango dinámico de recuento microscópico de focos está limitado por la resolución óptica, lo que lleva a la incapacidad de distinguir los focos superpuestos29,34. En la práctica, hemos observado una relación lineal entre la dosis de radiación y los números de foco sH2AX por debajo de 2 Gy, y un fuerte efecto de saturación por encima de 2 Gy en las células de glioblastoma U871. Por el contrario, la intensidad de la señal de la señal de H2AX medida por la citometría de flujo aumentó linealmente con la dosis para todo el intervalo de dosis probado (0-8 Gy).

La precisión del recuento microscópico de focos está limitada por la incapacidad de distinguir entre diferentes fases del ciclo celular sin manchas adicionales35. El número de DSB inducidos en una célula no sólo depende de la dosis de radiación, sino también del contenido de ADN y, por lo tanto, de la etapa del ciclo celular. Las células G2, por ejemplo, tienen el doble de ADN que las células G1 y el número medio de DSB inducidos a una dosis de radiación determinada es el doble de alto para las células G2 en comparación con G1. Esto se refleja claramente en la intensidad de la señal de la célula G2 frente a las células G1 en los primeros momentos después de la radiación medida por la citometría de flujo. Por lo tanto, es importante evaluar los niveles de DSB de una manera específica del ciclo celular para obtener resultados precisos. Un análisis agrupado de células en diferentes fases del ciclo celular, como es habitual en los enfoques microscópicos, puede ser sesgado por cambios en la distribución del ciclo celular particularmente debido a la detención g2 inducida por radiación. Para tener en cuenta este efecto y comparar las características de reparación del DSB entre las diferentes etapas del ciclo celular, los niveles de la clase H2AX se pueden normalizar fácilmente al contenido de ADN en el método de citometría de flujo, tal como se indica en el protocolo.

Las extensiones del protocolo actual son posibles con relativamente poco esfuerzo adicional. Los anticuerpos adicionales con etiquetas de fluoróforos compatibles se pueden incluir en el paso 3.4 sin necesidad de realizar ningún paso adicional durante la preparación de la muestra. Si se desea un análisis más detallado de la apoptosis, se podrían incluir anticuerpos caspasa-7, -9 y -8. Como otra extensión, recientemente hemos incluido un tinte de células vivas y muertas, un anticuerpo T de troponina y cuentas de recuento en el protocolo para analizar específicamente los cardiomiocitos co-cultivados con fibroblastos después de la irradiación. La adición de la mancha de células vivas/muertas y las cuentas de recuento amplía la capacidad del método para incluir la proliferación de fibroblastos y la muerte celular no apoptotica de los cardiomiocitos como otros puntos finales que proporcionan información adicional útil sobre la célula destino después del estrés genotóxico. El protocolo extendido está disponible bajo petición.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al equipo de Flow Cytometry Facility en el Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ) por su apoyo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL filter tips Nerbe plus 07-693-8300
100-1,000 µL pipette Eppendorf 3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size BD Falcon 352235
15 mL tubes BD Falcon 352096
200 µL filter tips Nerbe plus 07-662-8300
20-200 µL pipette Eppendorf 3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 BioLegend 613406 Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 BD Pharmingen 560626 Dilute 1:20
BD FACSClean solution BD Biosciences 340345 For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solution BD Biosciences 340346 For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Biochrom L 182 Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin Biochrom FG 0415 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absolute VWR 20821.330
Excel software Microsoft
FBS Superior (fetal bovine serum) Biochrom S 0615 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 software LLC online order
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hw NeoLab 11416
LSRII or LSRFortessa cytometer BD Biosciences
MG132 Calbiochem 474787 optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+ Heraeus
Paraformaldehyde AppliChem A3813 Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 Cell Signaling Technology #3475 Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2 Integra Biosciences 155 016
Serological pipettes, 10 mL Corning 4488
Serological pipettes, 25 mL Corning 4489
Serological pipettes, 5 mL Corning 4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) Biomol AG-40T-0002-C020 optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasks Greiner bio-one 690160 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-025500 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cells ATCC ATCC-HTB-14 Example cell line used in the protocol

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References

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Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo
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Lopez Perez, R., Münz, F., Kroschke, J., Brauer, J., Nicolay, N. H., Huber, P. E. Cell Cycle-specific Measurement of γH2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (151), e59968, doi:10.3791/59968 (2019).

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