Isolatie van stam-achtige cellen uit 3-dimensionale Spheroid-culturen
Summary
Met behulp van humane primaire prostaat Epitheelcellen, rapporteren we een nieuwe biomarker-vrije methode van functionele karakterisering van stam-achtige cellen door een spheroid-gebaseerde label-retentie test. Een stap-voor-stap protocol wordt beschreven voor BrdU, CFSE of far Red 2D Cell labeling; driedimensionale spheroid-formatie; Label-behoud stam-achtige celidentificatie door immunocytochemie; en isolatie door FACS.
Abstract
Ondanks vooruitgang bij adulte stamcelonderzoek blijft het identificeren en isoleren van stamcellen uit weefsel specimens een grote uitdaging. Hoewel ingezeten stamcellen relatief met niche-beperkingen in volwassen weefsels zijn, komen ze in de celcyclus in een anker vrije driedimensionale (3D) cultuur en ondergaan zowel symmetrische als Asymmetrische celdeling, wat leidt tot zowel stam als voorlopercellen Cellen. De laatste vermenigvuldigen zich snel en zijn de belangrijkste celpopulatie in verschillende stadia van de afstamming verbintenis, vormen heterogene spheroids. Met behulp van primaire normale humane prostaat epitheelcellen (HPrEC) werd een op spheroid gebaseerde, label-retentie test ontwikkeld die de identificatie en functionele isolatie van de spheroid-initiërende stamcellen in één celresolutie mogelijk maakt.
HPrEC-of cellijnen zijn twee-dimensioneel (2D) gecultiveerde met BrdU gedurende 10 dagen om de opname ervan in het DNA van alle scheidings cellen mogelijk te maken, inclusief zelf-vernieuwende stamcellen. Wassen begint bij overdracht naar de 3D-cultuur gedurende 5 dagen, waarbij stamcellen zichzelf verlengen via asymmetrische verdeling en de vorming van spheroid initiëren. Terwijl de relatief trillerende dochter stamcellen BrdU-gelabeld ouder-DNA behouden, vermenigvuldigen de dochter voor ouders zich snel en verliezen ze het BrdU-label. BrdU kan worden vervangen door CFSE of far Red Pro-kleurstoffen, die live stamcel isolatie door FACS mogelijk maken. Stamcel karakteristieken worden bevestigd door in-vitro-spheroid-vorming, in vivo weefselregeneratie testen, en door het documenteren van hun Symmetrische/asymmetrische celsplitsingen. De geïsoleerde stamcel cellen kunnen grondig worden ondervraagd door stroomafwaarts moleculaire en biologische studies, waaronder RNA-seq, chip-seq, single cell Capture, metabole activiteit, Proteoom profilering, immunocytochemie, organoïd vorming en in vivo weefselregeneratie. Belangrijk is dat deze marker-vrije functionele stamcel isolatie benadering stam-achtige cellen van verse kanker specimens en kankercellijnen uit meerdere organen identificeert, wat een brede toepasbaarheid suggereert. Het kan worden gebruikt om kanker stam-achtige cel biomarkers identificeren, scherm farmaceutische producten gericht op kanker stam-achtige cellen, en ontdek nieuwe therapeutische doelen in kankers.
Introduction
De menselijke prostaat klier bevat luminaal epitheel met secretoire functie en basale cellen onderliggende het samen met een ongewone neuro-endocriene cel component. De epitheelcellen, in dit geval, worden gegenereerd uit een zeldzame populatie van prostaat stamcellen die relatief stilzitten in vivo en fungeren als een reparatie systeem om klierweefsel homeostase gedurende het hele leven1. Ondanks veel vooruitgang blijft de identificatie en functionele isolatie van prostaat stamcellen een grote uitdaging in het veld. Stamcel biomarkers, met inbegrip van celoppervlak marker-gebaseerde methodologieën gecombineerd met Flow cytometrie worden vaak gebruikt voor stamcelonderzoek2,3,4. De resultaten voor verrijking en isolatie lopen echter sterk uiteen als functie van markerings combinaties en antilichaam specificiteit5,6, waarbij vragen worden gesteld over de identiteit van de geïsoleerde cellen. Een andere veelgebruikte aanpak voor stem-achtige celverrijking is driedimensionale (3D) spheroid-cultuur2,3,4. Terwijl ingezeten stamcellen relatief stilzitten in vivo met niche-beperkingen, ondergaan ze celdeling in 3D-matrix cultuur (zowel symmetrisch als asymmetrisch), waardoor zowel stam-als voorlopercellen worden gegenereerd die zich snel voortplanten in de richting van de Lineage-verbintenis7,8. De gevormde sferoïden zijn een heterogene mengeling die zowel stamcellen als voorlopercellen bevat in verschillende stadia van de afstamming, waaronder vroege en late stadia van voorlopercellen. Dus, assays met behulp van de hele sferoïden zijn niet stamcel exclusief, waardoor de identificatie van unieke stamcel eigenschappen onduidelijk. Daarom is het van cruciaal belang om assays te maken om prostaat stamcellen van hun dochter voor ouders te identificeren en te scheiden. In dit voordeel is het doel van het huidige protocol het vaststellen van een assay-systeem dat de efficiënte identificatie en isolatie van stamcellen van menselijke prostaat weefsels mogelijk maakt, gevolgd door een robuuste downstream-analyse van hun biologische functies.
Lange termijn 5-broom-2′-deoxyuridine (Brdu) label-retentie wordt veel gebruikt voor in vivo en in vitro tracering van stamcellen op basis van hun verlengde verdubbelingstijd9,10. De huidige aanpak voor de identificatie en isolatie van prostaat stamcellen die hierin wordt beschreven, is gebaseerd op hun relatieve trillende karakteristiek en label retentie eigenschappen binnen een gemengde epitheel populatie. Bovendien kunnen alleen stamcellen, op basis van de onsterfelijke streng DNA-hypothese, Asymmetrische celdeling ondergaan. De stamcel vertegenwoordigt de dochtercel die het oudere DNA van ouders bevat terwijl de voorlopercellen, die een toegewijde dochtercel is, het nieuw gesynthetiseerde DNA ontvangt. De unieke eigenschap van de stamcel die hierboven wordt beschreven, wordt gebruikt om BrdU-labeling uit te voeren in ouderlijke stamcellen in primaire culturen en vervolgens hun label na BrdU-washout bij te houden na overdracht naar 3D-anker vrije spheroid-cultuur. Hoewel het merendeel van de primaire prostaat epitheelcellen een basale en doorvoer versterkend fenotype in 2D-cultuur behouden, is er ook een zeldzame populatie van multipotente stamcellen die de epitheliale homeostase aanvullen en onderhouden, zoals blijkt uit de vorming van sferoïden of volledig gedifferentieerde organogeniden met overeenkomstige kweekmedia bij overdracht naar 3D-systemen3,12. In ons huidige protocol, met behulp van hprec prostaat sferoïden of prostasphere gebaseerde Brdu, CFSE, of far Red retentie testen gevolgd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), identificeren we label-behoud stamcellen in sferoïden op één cel niveau13.
Belangrijk is dat we de kenmerken van de stamcel van de cellen voor het behoud van etiketten in vroege stadia van sferoïden verder hebben bevestigd in vergelijking met de voorlopercellen met Lineage engagement. Dit zijn onder andere stamcel asymmetrische divisie, in vitro spheroid vorming vermogen en in vivo weefselregeneratie capaciteit, verhoogde autophagy activiteit, verhoogd ribosoom biogenese en verminderde metabole activiteit. Vervolgens werd RNAseq-analyse uitgevoerd. Differentiaal uitgedrukte genen in labelhoudende spheroid-cellen werden waargenomen die kunnen dienen als nieuwe biomarkers voor menselijke prostaat stamcellen. Deze op spheroid gebaseerde benadering van etikettering kan worden toegepast op kanker specimens om een klein aantal kanker stamachtige cellen te identificeren, waardoor translationele mogelijkheden worden geboden om de therapeutische resistente populaties13te beheren. Hieronder vindt u de prostasphere-based label-retentie assay met menselijke primaire prostaat epitheelcellen (HPrEC) als voorbeeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flow flowcytometrieonderzoeken met behulp van meerdere stamcel oppervlak markers is een veelgebruikte benadering voor stamcelonderzoek ondanks het ontbreken van zowel specificiteit en selectiviteit1,5,6. Terwijl spheroid-vorming in een 3D-cultuur systeem een andere nuttige methode is om de zeldzame stamcel populatie te verrijken van primaire Epitheelcellen, waaronder hprec, zijn de resulterende spheroïden nog steeds een heterog…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door subsidies van de National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). We danken de flow Cytometry core aan de Universiteit van Illinois in Chicago voor hulp bij het sorteren van cellen.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Referências
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Pesquisa do Câncer. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Pesquisa do Câncer. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
