Isolement des cellules souches des cultures sphéroïdes tridimensionnelles
Summary
Utilisant les cellules épithéliales primaires humaines de prostate, nous rapportons une nouvelle méthode biomarqueur-libre de caractérisation fonctionnelle des cellules de tige-comme par un test sphéroïde-basé d’étiquette-rétention. Un protocole étape par étape est décrit pour l’étiquetage des cellules BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formation sphénoïde tridimensionnelle; identification des cellules souches de conservation de l’étiquette par immunocytochimie; et l’isolement par FACS.
Abstract
Malgré les progrès de la recherche sur les cellules souches adultes, l’identification et l’isolement des cellules souches à partir de spécimens de tissus demeure un défi majeur. Bien que les cellules souches résidentes soient relativement calmes avec des contraintes de niche dans les tissus adultes, elles entrent dans le cycle cellulaire dans la culture tridimensionnelle sans ancre (3D) et subissent à la fois une division cellulaire symétrique et asymétrique, donnant naissance à la fois à la tige et à l’ancêtre. Cellules. Ces derniers prolifèrent rapidement et constituent la principale population cellulaire à divers stades de l’engagement de la lignée, formant des sphéroïdes hétérogènes. Utilisant les cellules épithéliales humaines normales primaires de prostate (HPrEC), un test sphéroïde, d’étiquette-rétention a été développé qui permet l’identification et l’isolement fonctionnel des cellules souches sphéroïdes-initiatrices à une résolution simple de cellules.
HPrEC ou lignées cellulaires sont cultivées en deux dimensions (2D) avec BrdU pendant 10 jours pour permettre son incorporation dans l’ADN de toutes les cellules de division, y compris les cellules souches auto-renouvelables. Le lavage commence lors du transfert à la culture 3D pendant 5 jours, au cours desquels les cellules souches se renouvellent par division asymétrique et initient la formation sphéroïde. Tandis que les cellules souches de fille relativement calmes conservent l’ADN parental BrdU-étiqueté, les ancêtres de fille prolifèrent rapidement, perdant l’étiquette brdU. Le BrdU peut être remplacé par des colorants pro CFSE ou Far Red, qui permettent l’isolement des cellules souches vivantes par le FACS. Les caractéristiques des cellules souches sont confirmées par la formation in vitro de sphéroïdes, les essais de régénération des tissus in vivo et la documentation de leurs divisions cellulaires symétriques/asymétriques. Les cellules souches isolées qui conservent l’étiquette peuvent être rigoureusement interrogées par des études moléculaires et biologiques en aval, y compris l’ARN-seq, le ChIP-seq, la capture d’une seule cellule, l’activité métabolique, le profilage du protéome, l’immunocytochimie, la formation d’organoïdes et la régénération des tissus in vivo. Fait important, cette approche d’isolement des cellules souches fonctionnelles sans marqueuridentifie les cellules souches à partir de spécimens de cancer frais et de lignées de cellules cancéreuses provenant de plusieurs organes, ce qui suggère une large applicabilité. Il peut être utilisé pour identifier les biomarqueurs de cellules souches du cancer, dépister les produits pharmaceutiques ciblant les cellules souches cancéreuses et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques dans les cancers.
Introduction
La prostate humaine contient l’épithélium luminal avec la fonction sécrétrice et les cellules basales la sous-jacente s’il y a un composant neuroendocrine peu commun de cellules. Les cellules épithéliales, dans ce cas, sont générées à partir d’une population rare de cellules souches de la prostate qui sont relativement calmes in vivo et agissent comme un système de réparation pour maintenir l’homéostasie glandulaire tout au long de la vie1. Malgré de nombreux progrès, l’identification et l’isolement fonctionnel des cellules souches de la prostate demeurent un défi majeur dans le domaine. Les biomarqueurs de cellules souches, y compris les méthodologies basées sur les marqueurs de surface cellulaire combinés à la cytométrie du débit sont couramment utilisés pour la recherche sur les cellules souches2,3,4. Cependant, les résultats pour l’enrichissement et l’isolement varient considérablement en fonction des combinaisons de marqueurs et de la spécificité d’anticorps5,6, soulevant des questions au sujet de l’identité des cellules isolées. Une autre approche largement utilisée pour l’enrichissement cellulaire de type souche est la culture sphéroïde tridimensionnelle (3D)2,3,4. Bien que les cellules souches résidentes soient relativement calmes in vivo avec des contraintes de niche, elles subissent une division cellulaire dans la culture de la matrice 3D (à la fois symétrique et asymétrique), générant à la fois des cellules souches et progénitrices qui se reproduisent rapidement vers l’engagement de lignée7,8. Les sphéroïdes formés sont un mélange hétérogène contenant à la fois des cellules souches et des cellules progénitrices à divers stades de l’engagement de la lignée, y compris les cellules progénitrices à un stade précoce et avancé. Ainsi, les essais utilisant l’ensemble des sphéroïdes ne sont pas exclusifs aux cellules souches, ce qui rend l’identification des propriétés uniques des cellules souches non concluante. Par conséquent, il est essentiel de créer des essais pour identifier et séparer les cellules souches de la prostate de leurs ancêtres filles. À cette fin, l’objectif du protocole actuel est d’établir un système d’analyse qui permet l’identification efficace et l’isolement des cellules souches des tissus de la prostate humaine suivies d’une analyse robuste en aval de leurs fonctions biologiques.
La rétention à long terme de l’étiquette 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) est largement utilisée pour le traçage in vivo et in vitro des cellules souches en fonction de leur temps de doublement prolongé9,10. L’approche actuelle pour l’identification et l’isolement de cellules souches de prostate décrites ci-dessus est basée sur leurs caractéristiques quiescentes relatives et leurs propriétés d’étiquette-rétention dans une population épithéliale mélangée. En outre, sur la base de l’hypothèse de l’ADN brin immortel, seules les cellules souches peuvent subir une division asymétrique des cellules. La cellule souche représente la cellule fille qui contient l’ADN parental plus ancien tandis que la cellule progénitrice, qui est une cellule fille engagée, reçoit l’ADN nouvellement synthétisé. La propriété unique de cellules souches décrite ci-dessus est exploitée pour effectuer l’étiquetage BrdU dans les cellules souches parentales dans les cultures primaires, puis suivre leur étiquette après BrdU-washout lors du transfert à la culture sphéroïde 3D sans ancrage. Tandis que la majorité des cellules épithéliales primaires de prostate maintiennent un phénotype basal et de transit amplifiant dans la culture 2D, il y a également une population rare de cellules souches multipotentes réapprovisionnant et maintenant l’homéostasie épithéliale comme démontré par la formation des sphéroïdes ou des organoïdes entièrement différenciés avec les médias de culture correspondants sur le transfert aux systèmes 3D3,12. Dans notre protocole actuel, en utilisant des sphéroïdes de la prostate HPrEC ou des tests de rétention BrdU, CFSE ou Far Red à base de prostasphere, suivis du tri des cellules activées par la fluorescence (FACS), nous identifions les cellules souches qui conservent l’étiquette dans les sphéroïdes à un seul niveau cellulaire13.
Fait important, nous avons confirmé en outre les caractéristiques des cellules souches des cellules de rétention d’étiquette dans les sphéroïdes à un stade précoce par rapport aux cellules progénitrices avec engagement de lignée. Ceux-ci incluent la division asymétrique de cellules souches, la capacité de formation sphéroïde in vitro et la capacité de régénération in vivo de tissu, l’activité élevée d’autophagie, la biogenèse augmentée de ribosome et l’activité métabolique diminuée. Par la suite, l’analyse de RNAseq a été exécutée. Des gènes exprimés différemment dans les cellules sphéroïdes qui conservent l’étiquette ont été observés qui peuvent servir de nouveaux biomarqueurs pour les cellules souches de la prostate humaine. Cette approche de conservation de l’étiquette à base de sphéroïdes peut s’appliquer aux échantillons de cancer afin d’identifier de la même façon un petit nombre de cellules souches cancéreuses, offrant ainsi des possibilités translationnelles de gérer les populations résistantes à la thérapeutique13. Présenté ci-dessous est le test de rétention d’étiquette à base de prostasphère à l’aide de cellules épithéliales primaires humaines de la prostate (HPrEC) à titre d’exemple.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cytométrie de flux utilisant plusieurs marqueurs de surface de cellules souches est une approche couramment utilisée pour la recherche sur les cellules souches, bien qu’elle manque à la fois de spécificité et de sélectivité1,5,6. Tandis que la formation de sphéroïdes dans un système de culture 3D est une autre méthode utile en enrichissant la population rare de cellules souches des cellules épithéliales primaires…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions du National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Nous remercions le Flow Cytometry Core de l’Université de l’Illinois à Chicago pour son aide sur le tri cellulaire.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Referências
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