3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon
Summary
İnsan primer prostat epitel hücreleri kullanarak, kök benzeri hücrelerin küresel tabanlı etiket tutma testi ile fonksiyonel karakterizasyonu için yeni bir biyomarker-free yöntemi ni rapor ediyoruz. BrdU, CFSE veya Far Red 2D hücre etiketlemesi için adım adım bir protokol tanımlanır; üç boyutlu küresel oluşum; immünositokimya ile etiket tutucu kök benzeri hücre tanımlama; ve FACS tarafından izolasyon.
Abstract
Yetişkin kök hücre araştırmalarında gelişmelere rağmen, doku örneklerinden kök hücrelerin tanımlanması ve izole edilmesi büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Yerleşik kök hücreler yetişkin dokularda niş kısıtlamalar ile nispeten quiescent iken, onlar çapa içermeyen üç boyutlu (3D) kültür hücre döngüsü girmek ve hem simetrik hem de asimetrik hücre bölünmesi geçmesi, hem kök ve ata yol açan Hücre. İkincisi hızla çoğalır ve heterojen sferoidler oluşturan, soy taahhüdü çeşitli aşamalarında büyük hücre popülasyonuvardır. Primer normal insan prostat epitel hücreleri (HPrEC) kullanılarak, küresel tabanlı, etiket tutma testi, tek bir hücre çözümünde spheroid başlatan kök hücrelerin tanımlanmasına ve işlevsel olarak izole edilmesine izin veren geliştirilmiştir.
HPrEC veya hücre hatları, brdu ile 10 gün boyunca iki boyutlu (2D) kültürlü dürveterek, kendi kendini yenileyen kök hücreler de dahil olmak üzere tüm bölücü hücrelerin DNA’sına dahil edilmesine izin verir. Yıkama, 3D kültürüne aktarılmasıyla 5 gün boyunca başlar ve bu süre zarfında kök hücreler asimetrik bölünme yoluyla kendini yeniler ve küresel oluşumu başlatır. Nispeten quiescent kızı kök hücreleri BrdU etiketli ebeveyn DNA korumak iken, kız ataları hızla çoğalır, BrdU etiketi kaybetme. BrdU CFSE veya Far Red pro-boyalar ile değiştirilebilir, hangi FACS tarafından canlı kök hücre izolasyonu izin. Kök hücre özellikleri in vitro küresel formasyon, in vivo doku rejenerasyon uyrukları ve simetrik/asimetrik hücre bölünmelerini belgeleyerek doğrulanır. İzole etiket istinat kök hücreleri, RNA-seq, ChIP-seq, tek hücre yakalama, metabolik aktivite, proteom profilleme, immünositokimya, organoid oluşumu ve in vivo doku rejenerasyonu gibi moleküler ve biyolojik çalışmalarla titizlikle sorgulanabilir. Daha da önemlisi, bu marker-free fonksiyonel kök hücre izolasyon yaklaşımı taze kanser örnekleri ve birden fazla organdan kanser hücre hatları kök benzeri hücreleri tanımlar, geniş uygulanabilirlik düşündüren. Bu kanser kök benzeri hücre biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılabilir, kanser kök benzeri hücreleri hedefleyen ekran ilaç, ve kanserlerde yeni tedavi hedefleri keşfetmek.
Introduction
İnsan prostat bezi salgı fonksiyonu ve bazal hücreleri alışılmadık bir nöroendokrin hücre bileşeni ile birlikte altında yatan luminal epitel içerir. Epitel hücreleri, Bu durumda, vivo nispeten quiescent prostat kök hücrelerinin nadir bir popülasyondan oluşturulur ve yaşam boyunca glandüler homeostaz korumak için bir onarım sistemi olarak hareket1. Birçok ilerlemeye rağmen, prostat kök hücrelerinin tanımlanması ve fonksiyonel izolasyonu bu alanda önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Kök hücre biyobelirteçleri, akış sitometrisi ile birlikte hücre yüzeyi marker tabanlı metodolojiler de dahil olmak üzere yaygın kök hücre araştırma 2içinkullanılır2,3,4. Ancak, zenginleştirme ve izolasyon sonuçları marker kombinasyonları ve antikor özgüllüğü bir fonksiyonu olarak büyük ölçüde değişir5,6, izole hücrelerin kimliği hakkında sorular yükselterek. Kök benzeri hücre zenginleştirme için başka bir yaygın olarak kullanılan yaklaşım üç boyutlu (3D) küresel kültür2,3,4. Yerleşik kök hücreler niş kısıtlamalar ile vivo nispeten quiescent iken, onlar 3D matris kültüründe hücre bölünmesi geçmesi (hem simetrik ve asimetrik), hızla soy taahhüdü doğru çoğaltmak hem kök ve progenitor hücreleri üreten7,8. Oluşan küresel oidler, erken ve geç evre progenitor hücreleri de dahil olmak üzere, soy bağlılığının çeşitli aşamalarında hem kök hücreleri hem de progenitor hücreleri içeren heterojen bir karışımdır. Böylece, tüm küreseloidler kullanarak tahliller kök hücre özel değildir, benzersiz kök hücre özelliklerinin belirlenmesi sonuçsuz hale. Bu nedenle, kız larının atalarından prostat kök hücrelerini tanımlamak ve ayırmak için tahliller oluşturmak çok önemlidir. Bu doğrultuda, mevcut protokolün amacı, insan prostat dokularından kök hücrelerin etkin bir şekilde tanımlanmasıve izole edilmesine ve ardından biyolojik fonksiyonlarının sağlam downstream analizine olanak sağlayan bir tahlil sistemi kurmaktır.
Uzun süreli 5-bromo-2′-deoksiürinin (BrdU) etiket tutma yaygın olarak in vivo ve in vitro soy onların uzun katlama süresi 9 dayalı kök hücrelerin izlenmesi için kullanılır9,10. Burada tanımlanan prostat kök hücre tanımlama ve izolasyonu için mevcut yaklaşım, karışık epitel popülasyondaki göreceli kuskus karakteristiklerine ve etiket tutma özelliklerine dayanmaktadır. Ayrıca, ölümsüz iplikçik DNA hipotezine dayanarak, sadece kök hücreler asimetrik hücre bölünmesi geçirebilir. Kök hücre, büyük ebeveyn DNA’sını içeren kız hücresini temsil ederken, kendini adamış bir kız hücresi olan ata hücresi yeni sentezlenen DNA’yı alır. Yukarıda açıklanan benzersiz kök hücre özelliği birincil kültürlerde ebeveyn kök hücrelerinde BrdU etiketleme gerçekleştirmek ve daha sonra 3D çapa ücretsiz küresel kültüre transfer üzerine BrdU-washout aşağıdaki etiket izlemek için istismar edilir. Primer prostat epitel hücrelerinin çoğunluğu 2D kültürde bazal ve transit yükseltici fenotip korurken, aynı zamanda multipotent kök hücrelerin nadir bir popülasyon ulaştırır ve epitel homeostazı korumak gibi sferoidler veya 3Dsistemleretransferi üzerine ilgili kültür medya ile tam farklılaşmış organoidler oluşumu ile kanıtlandı12. Mevcut protokolümüzde, HPrEC prostat küreseloidleri veya prostasphere tabanlı BrdU, CFSE veya Uzak Kırmızı retansiyon testlerini ve ardından floresan aktif hücre sıralamasını (FACS) kullanarak, tek bir hücre düzeyinde sferoidlerde etiket tutucu kök hücreleri tanımlıyoruz13.
Daha da önemlisi, erken evre küresel hücrelerdeki etiket tutucu hücrelerin kök hücre özelliklerini soy taahhüdü ne göre daha da doğruladık. Bunlar arasında kök hücre asimetrik bölünmesi, in vitro küresel formasyon yeteneği ve in vivo doku rejenerasyon kapasitesi, yüksek otofaji aktivitesi, artırılmış ribozom biyogenezi ve azalmış metabolik aktivite sayılabilir. Daha sonra RNAseq analizi yapıldı. Etiket-istinat küresel hücrelerinde farklı olarak ifade edilen genlerin insan prostat kök hücreleri için yeni biyobelirteçler olarak hizmet edebileceği gözlenmiştir. Bu sheroid tabanlı etiket tutma yaklaşımı benzer kanser kök benzeri hücrelerin az sayıda belirlemek için kanser örnekleri için geçerli olabilir, böylece terapötik dirençli popülasyonları yönetmek için çeviri fırsatları sağlayan13. Aşağıda sunulan prostasphere tabanlı etiket tutma testi insan primer prostat epitel hücreleri kullanarak (HPrEC) bir örnek olarak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birden fazla kök hücre yüzey belirteçleri kullanarak Akış sitometrisi hem özgüllük ve seçicilik1,5,6eksik rağmen kök hücre araştırmaları için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Bir 3D kültür sisteminde küresel oluşumu birincil epitel hücrelerinden nadir kök hücre popülasyonunu zenginleştirmede başka yararlı bir yöntem iken, HPrEC dahil, ortaya çıkan sferoidler hala kök ve progenitor h?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Kanser Enstitüsü R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH) hibeleri ile desteklenmiştir. Biz hücre sıralama konusunda yardım için Chicago Illinois Üniversitesi’nde Akış Sitometri Çekirdek teşekkür ederiz.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Referências
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Pesquisa do Câncer. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Pesquisa do Câncer. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
