בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד
Summary
שימוש בתאי אפיתל הערמונית העיקרי האנושי, אנו מדווחים על שיטה ביוארינקר הרומן החופשי של אפיון פונקציונלי של תאים גזע דמוי על ידי שמירת תווית מבוסס ספרואיד מבוססי. פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור BrdU, CFSE, או הרחוק האדום תיוג תא 2D; היווצרות ספרואיד תלת מימדי; זיהוי תאים מתמך בתוויות באמצעות כימיה חיסונית מדומה; ובידוד על ידי FACS.
Abstract
למרות ההתקדמות במחקר תאי גזע מבוגרים, זיהוי ובידוד של תאי גזע מדגימות רקמה נשאר אתגר גדול. בעוד תאי גזע תושב הם השקט יחסית עם מרסנים נישה ברקמות מבוגרים, הם נכנסים למחזור התא בתרבות תלת-מימדית תלת ממדית (3D) ולעבור שתי החלוקה התא סימטרי ו אסימטרית, המעניקה הן גזע ומחולל קדמון תאים. האחרון מתרבים במהירות, הם אוכלוסיית התאים העיקריים בשלבים שונים של מחויבות השושלת, היוצרים spheroids הטרוגנית. באמצעות העיקרי האנושי נורמלי האפיתל הערמונית תאים (HPrEC), מבוסס ספרואיד, שמירה על התווית שיטת השמירה פותחה כי מאפשר זיהוי ובידוד פונקציונלי של תאי גזע ספרואיד ליזום ברזולוציה תא יחיד.
HPrEC או קווי התאים הם דו מימדי (2D) תרבותי עם BrdU 10 ימים כדי לאפשר התאגדות שלה ל-DNA של כל התאים המפריד, כולל תאי גזע לחידוש עצמי. לשטוף את מתחיל עם העברה לתרבות תלת-ממד עבור 5 ימים, במהלכה תאי גזע להתחדש באמצעות חלוקה אסימטרית וליזום היווצרות ספרואיד. בעוד השקט יחסית בתאי גזע בת לשמור BrdU התווית DNA הורים, הבת ושלתי מתרבים במהירות, לאבד את תווית BrdU. BrdU יכול להיות החליף עם CFSE או בצבע אדום הפרו-צבעים, אשר להתיר בידוד תא גזע חי על ידי FACS. מאפייני תא גזע מאושרים על ידי היווצרות מחוץ למבחנה, בvivo רקמות התחדשות הרקמה, ועל ידי תיעוד חטיבות התאים סימטרי/אסימטרי שלהם. בודדים מותג תוויות בתאי גזע ניתן לחקור בקפדנות על ידי במורד לימודים מולקולריים הביולוגיים, כולל RNA-seq, שבב-seq, לכידת תא בודד, פעילות מטבולית, פרופיל פרוטדום, אימונולוציטוכימיה, היווצרות אורגאיד, והתחדשות רקמות vivo. חשוב לציין, זה מסמן הגישה חופשי גזע פונקציונלי בידוד מזהה תאים גזע כמו מדגימות סרטן טריים ושורות תאים סרטניים מאיברים מרובים, מציע ישימות רחב. זה יכול לשמש כדי לזהות את הסרטן כמו גזע תאים ביוארקרס, תרופות המסך מיקוד סרטן כמו תאים, ולגלות מטרות טיפוליות הרומן סרטן.
Introduction
בלוטת הערמונית האנושית מכיל אפיתל הלומינום עם תפקוד הפרשה ותאי בסיס המשמשים אותו יחד עם רכיב חריג מנוירואנדוקריניים תאים. התאים האפיתל, במקרה זה, נוצרות מאוכלוסיה נדירה של תאי גזע הערמונית כי הם השקט יחסית vivo ולפעול כמערכת תיקון כדי לשמור על הומאוסטזיס בלוטות ברחבי החיים1. למרות מספר מקדמות, הבידוד ההזדהות והפונקציונלי של תאי גזע הערמונית נשאר אתגר גדול בתחום. תא גזע ביואריטים, כולל מתודולוגיות מבוססות סמן תא מבוסס בשילוב עם הזרמת cy, משמשים בדרך כלל עבור מחקר תאי גזע2,3,4. עם זאת, תוצאות עבור העשרה ובידוד להשתנות באופן נרחב כפונקציה של שילובים סמן ונוגדן ספציפיות5,6, העלאת שאלות על זהותו של התאים המבודדים. גישה נוספת בשימוש נרחב עבור העשרה תאים גזע דמוי הוא תלת מימדי (3d) תרבות ספרואיד2,3,4. בעוד תאי גזע תושב הם השקט יחסית ב vivo עם מרסנים נישה, הם עוברים חלוקת התא בתרבות מטריקס תלת-ממד (הן סימטרי ו-אסימטרי), יצירת תאים גזע ומחולל קדמון במהירות להתרבות לכיוון שושלת היוחסין7,8. הרורואידים שנוצרו הם תערובת הטרוגנית המכילה תאי גזע ותאים מחולל שלבים בשלבים שונים של מחויבות השושלת, כולל מוקדם ומאוחר תאים בשלב הקדמון. כך, בחני אומר שימוש בspheroids כולו אינם תא גזע בלעדי, מה שהופך את הזיהוי של מאפייני תא גזע ייחודי לא חד-משמעית. לכן, זה קריטי ליצור בחני לזהות ולהפריד תאים גזע הערמונית ושלתי בתם. לקראת סוף זה, המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא להקים מערכת שיטה המאפשרת זיהוי יעיל ובידוד של תאי גזע מרקמות הערמונית האנושית ואחריו בדיקה חזקה במורד הזרם של התפקודים הביולוגיים שלהם.
לטווח ארוך 5-bromo-2′-deoxyuridine (bromo) תווית-שימור משמש רבות עבור vivo ובמעקב השושלת מבחנה של תאי גזע מבוסס על זמן ההכפלה הממושך שלהם9,10. הגישה הנוכחית לזיהוי תא גזע הערמונית ובידוד המתואר בזאת מבוססת על המאפיין השקט היחסי שלהם והחזקת תוויות בתוך אוכלוסיית אפיתל מעורבת. יתר על כן, מבוסס על השערת ה-DNA גדיל הנצחי, רק תאי גזע יכולים לעבור חלוקת תאים אסימטריים. תא הגזע מייצג את התא הבת המכיל את ה-DNA הורים מבוגרים בעוד התא מחולל, שהוא תא הבת מחויבת, מקבל את ה-DNA החדש מסונתז. המאפיין תא גזע ייחודי המתואר לעיל הוא ניצל כדי לבצע תיוג BrdU בתאי גזע הורים בתרבויות הראשיות ולאחר מכן לעקוב אחר התווית שלהם בעקבות BrdU-כשלון בעת העברת 3D עוגן-התרבות ספרואיד ללא. בעוד שרוב התאים העיקריים האפיתל הערמונית לשמור על בסיס ומעבר הגברה פנוטיפ בתרבות 2d, יש גם אוכלוסייה נדירה של תאים גזע רב עוצמה מחידוש ושמירה על הומאוסטזיס אפיתל כפי שמעידים על ידי היווצרות spheroidsאו באופןמלא אורגנואידים עם מדיה התרבות המתאימהעם העברתמערכות 3d3 בפרוטוקול הנוכחי שלנו, באמצעות הערמונית hprec באמצעות spheroids או prostasphere מבוסס brdu, cfse, או שמירה האדום הרחוק בחני מיון הופעל על ידי האתר הפעיל פלואורסצנטית (facs), אנו מזהים בתאי גזע שמירת תוויות ב spheroids ברמת תא בודד13.
חשוב לעשות זאת, אנו מאשרים את תאי הגזע של תאים התומכים בתוויות בתוך השלב המוקדם בהשוואה לתאי הקדמון עם מחויבות השושלת. אלה כוללים החלוקה האסימטרית של תא גזע, ביכולת היווצרות מחוץ לתחום העור ובקיבולת התחדשות vivo רקמות, פעילות אוטומטית מוגבר, הריבובביוגנזה מורחבת וירידה בפעילות מטבולית. לאחר מכן, ניתוח RNAseq בוצע. דיפרנציאלי הביע גנים בתאים ספרואיד שמירת תוויות נצפו כי עשוי לשמש בסמנים הרומן עבור תאים גזע האדם הערמונית. זו הגישה מבוססי תווית שמירה על תוויות יכול לחול על דגימות סרטן כדי לזהות באופן דומה מספר קטן של תאים גזע דמוי סרטן, ובכך מספק הזדמנויות translational לנהל את אוכלוסיות עמידות טיפולית13. המוצג להלן הוא prostasphere מבוססי תווית שמירה שיטת השמירה באמצעות תאים האפיתל הערמונית העיקרי האנושי (HPrEC) כדוגמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזרמת cy, לנסות באמצעות מספר סמנים פני השטח גזע היא גישה נפוץ עבור מחקר תאי גזע למרות המחסור הן ספציפיות ובסלקטיביות1,5,6. בעוד היווצרות ספרואיד במערכת תרבות תלת-ממד היא עוד שיטה שימושית בהעשרת האוכלוסיה הנדירה של תאי גזע מתאי האפיתל העיקרי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מן המכון הלאומי לסרטן R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). אנו מודים לליבת הזרימה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו לסיוע במיון תאים.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Referências
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Pesquisa do Câncer. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Pesquisa do Câncer. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
