3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리
Summary
인간의 1차 전립선 상피 세포를 사용하여, 우리는 스페로이드 기반 의 라벨 보유 분석법에 의해 줄기 유사 세포의 기능적 특성화의 새로운 바이오마커 없는 방법을 보고합니다. BrdU, CFSE, 또는 파 레드 2D 셀 라벨링에 대해 단계별 프로토콜이 기재되어; 3 차원 스페로이드 형성; 면역 세포 화학에 의한 라벨-유지 줄기 유사 세포 식별; 및 FACS에 의해 격리.
Abstract
성인 줄기 세포 연구에 있는 어드밴스에도 불구하고, 조직 견본에서 줄기 세포의 확인 그리고 격리는 중요한 도전남아 있습니다. 상주 줄기 세포는 성인 조직에 틈새 구속으로 상대적으로 정지하는 동안, 그들은 앵커없는 3 차원 (3D) 배양에서 세포 주기를 입력하고 대칭 및 비대칭 세포 분열을 모두 겪으며 줄기와 전구 모두를 초래합니다. 셀. 후자는 급속하게 증식하고 이질적인 스페로이드를 형성하는 계보 헌신의 각종 단계에서 중요한 세포 인구입니다. 일차 정상 인간 전립선 상피 세포(HPrEC)를 사용하여, 스페로이드 기반의 라벨 보존 분석법으로 단일 세포 분해능에서 스페로이드 를 발동하는 줄기 세포의 식별 및 기능적 분리를 허용하는 것으로 개발되었다.
HPrEC 또는 세포주들은 2차원(2D) BrdU와 함께 10일 동안 배양되어 자가 갱신 줄기 세포를 포함한 모든 분할 세포의 DNA에 혼입하는 것을 허용한다. 5 일 동안 3D 배양으로 옮겨지면 씻어 내고, 그 동안 줄기 세포는 비대칭 분열을 통해 스스로 갱신하고 스페로이드 형성을 시작합니다. 상대적으로 정지딸 줄기세포가 BrdU 표지된 부모 DNA를 유지하는 동안, 딸 선조는 BrdU 라벨을 잃고 급속하게 증식합니다. BrdU는 FACS에 의한 살아있는 줄기 세포 격리를 허용하는 CFSE 또는 파 레드 프로 염료로 대체될 수 있습니다. 줄기 세포 특성은 생체 외 스페로이드 형성, 생체 내 조직 재생 분석 및 대칭 / 비대칭 세포 분열을 문서화하여 확인됩니다. 단리된 라벨-유지 줄기 세포는 RNA-seq, ChIP-seq, 단세포 포획, 대사 활성, 프로테오메 프로파일링, 면역 세포 화학, 오르가노이드 형성 및 생체 내 조직 재생을 포함한 다운스트림 분자 및 생물학적 연구에 의해 엄격하게 심문될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 마커 자유로운 기능적인 줄기 세포 격리 접근은 다중 기관에서 신선한 암 견본 및 암 세포줄에서 줄기 같이 세포를, 넓은 적용성을 건의합니다. 암 줄기 와 같은 세포 바이오마커를 식별하고, 암 줄기와 같은 세포를 표적으로 하는 의약품을 선별하고, 암에서 새로운 치료 표적을 발견하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
인간 전립선은 분비 기능과 특이한 신경 내분비 세포 성분과 함께 기본 기저 세포를 가진 발광 상피를 포함합니다. 상피 세포는, 이 경우에, 생체 내에서 상대적으로 정지하고 일생 내내 선 항상성을 유지하기 위하여 복구 시스템으로 작용하는 전립선 줄기 세포의 희소한 인구에서 생성됩니다1. 많은 발전에도 불구하고, 전립선 줄기 세포의 식별 및 기능적 격리는 분야에서 중요한 과제로 남아 있습니다. 세포 표면 마커 기반 방법론을 포함하는 줄기 세포 바이오마커는 유세포 분석과 결합되어 줄기세포 연구2,3,4에일반적으로 사용된다. 그러나, 농축 및 격리에 대한 결과는 마커 조합 및 항체 특이성의 함수로서 광범위하게변화하며,6,단리된 세포의 정체성에 대한 의문을 제기한다. 줄기형 세포 농축을 위한 또 다른 널리 사용되는 접근법은 3차원(3D) 스페로이드배양2,3,4이다. 상주 줄기세포는 틈새 구속을 가진 생체 내에서 상대적으로 정지되어 있는 반면, 이들은 3D 매트릭스 배양(대칭 및 비대칭 둘 다)에서 세포 분열을 겪고, 줄기 세포와 전구 세포를 모두 생성하여 계보약정7,8을향해 빠르게 재생한다. 형성된 스페로이드는 초기 및 후기 전구 세포를 포함하여 계보 헌신의 각종 단계에서 줄기 세포 및 전구 세포를 모두 포함하는 이기종 혼합물입니다. 따라서, 전체 스페로이드를 이용한 세포는 줄기 세포 배타적이지 않으며, 독특한 줄기 세포 특성의 식별이 결정적이지 않다. 따라서, 그들의 딸 전구에서 전립선 줄기 세포를 확인하고 분리하기 위하여 분석사를 만드는 것이 중요합니다. 이를 위해, 현재 프로토콜의 목표는 인간 전립선 조직으로부터 줄기 세포를 효율적으로 식별하고 분리할 수 있는 분석 시스템을 수립하고 생물학적 기능에 대한 강력한 하류 분석을 하는 것입니다.
장기 5-브로모-2′-데옥시우리딘(BrdU) 라벨-보유는 그들의 장기간 두 배의 시간9,10에기초하여 줄기 세포의 생체 내 및 시험관 내 계보 추적에 널리 사용된다. 본원에 기재된 전립선 줄기 세포 식별 및 격리에 대한 현재의 접근법은 혼합 상피 집단 내에서 그들의 상대적 정지 특성 및 라벨 보유 특성에 기초한다. 더욱이, 불멸의 가닥 DNA 가설에 기초하여, 오직 줄기 세포만이 비대칭 세포 분열을 겪을 수 있다. 줄기 세포는 더 오래된 부모 DNA를 포함하는 딸 세포를 나타내고, 전구 세포는, 투입된 딸 세포인, 새로 합성된 DNA를 수신합니다. 위에서 설명한 독특한 줄기 세포 특성은 1 차 적인 배양에서 부모 줄기 세포에서 BrdU 라벨을 수행하고 3D 앵커가없는 스페로이드 배양으로 옮길 때 BrdU 세척 다음 라벨을 추적하기 위해 악용됩니다. 1차 전립선 상피 세포의 대다수가 2D 배양에서 기저 및 이동 증폭 표현형을 유지하는 반면, 3D시스템으로전달시 해당 배양 배지를 가진 구형 또는 완전히 분화된 오르가노이드의 형성에 의해 입증된 바와 같이 상피 항상성을 보충하고 유지하는 다능성 줄기 세포의 드문 집단이 있다3,12. 현재 프로토콜에서, HPrEC 전립선 스페로이드 또는 프로스타스피어 계 BrdU, CFSE, 또는 원적 보유 분석법에 이어 형광 활성 세포 선별(FACS)을 사용하여, 단일 세포 수준13에서스페로이드에서 라벨 유지 줄기 세포를 식별합니다.
중요한 것은, 우리는 계보 투입을 가진 전구 세포에 비교된 초기 단계 스페로이드 내의 표지 보유 세포의 줄기 세포 특성을 추가로 확인했습니다. 이들은 줄기 세포 비대칭 분열, 시험관 내 스페로이드 형성 능력 및 생체 외 조직 재생 능력, 높은 autophagy 활동, 증강 리보솜 생물 발생 및 감소된 신진 대사 활동을 포함합니다. 이어서, RNAseq 분석을 수행하였습니다. 표지 유지 스페로이드 세포에서 분과적으로 발현된 유전자는 인간 전립선 줄기 세포에 대한 신규한 바이오마커로서 작용할 수 있음을 관찰하였다. 이러한 스페로이드 계 라벨-고정 접근법은 암 표본에 적용하여 소수의 암 줄기 유사 세포를 유사하게 식별할 수 있으며, 따라서 치료 내성집단(13)을관리할 수 있는 번역 기회를 제공한다. 아래에 제시된 것은 인간 1차 전립선 상피 세포(HPrEC)를 예로 사용하는 전립선계 라벨 보유 분석이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다중 줄기세포 표면 마커를 이용한 유세포측정법은 특이성과 선택성 모두 결여에도 불구하고 줄기세포 연구를 위해 일반적으로 사용되는접근법1,5,6. 3D 배양 시스템에서 스페로이드 형성은 HPrEC를 포함하는 1 차 상피 세포로부터 희귀 줄기 세포 집단을 풍부하게 하는 또 다른 유용한 방법이지만, 생성된 스페로이드는 여전히 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 암 연구소 R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 시카고 일리노이 대학의 유동 세포 측정 코어에 세포 선별에 대한 도움을 주셔서 감사합니다.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Referências
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