分析泛性基质和泛性基质样的依从性转化后修饰和重大改变的识别
Summary
该协议旨在建立泛素 （Ub） 和泛素样 （Ubls） 特定蛋白酶，以便识别与特定条件（如治疗或表型）相关的此类翻译后修饰 （PTM） 的更改。
Abstract
蛋白质的泛素（ub）和泛素样（ubl）依赖性转化后修饰通过控制蛋白质稳定性、活性、相互作用和细胞内定位，在细胞内发挥基本的生物调节作用。它们使细胞能够响应信号并适应其环境的变化。这些机制内的改变可能导致严重的病理情况，如神经退行性疾病和癌症。此处描述的技术的目的是从培养的细胞系快速准确地建立 ub/ubls 依赖型 PTM 配置文件。比较从不同条件下获得的不同轮廓，可以识别特定的改变，例如治疗引起的改变。Lentiviral介导细胞转导用于创建稳定的细胞系，表达修饰剂的双标记（6His和Flag）版本（泛素或ubl，如SUMO1或Nedd8）。这些标签允许从细胞中纯化泛基蛋白，因此也允许泛泛蛋白。这通过两步纯化过程完成：第一个在变性条件下使用 6His 标记执行，第二个在本机条件下使用 Flag 标记执行。这导致对修饰蛋白进行高度特异性和纯分离，随后通过液相色谱技术进行识别和半量化，然后采用串联质谱法（LC-MS/MS）技术。使用 Excel 软件对 MS 数据进行轻松的信息化分析，通过消除背景信号，可以建立 PTM 配置文件。这些配置文件在每个条件之间进行比较，以便确定具体的变化，然后更具体地研究，从标准生物化学技术验证开始。
Introduction
这里提出的方法致力于研究由培养的哺乳动物细胞中泛素家族成员介导的PTM，以便识别与特定条件（治疗、分化等）相关的潜在变化。PTM代表蛋白质功能调节的最后一步1。事实上，一旦由翻译机制产生，大多数（如果不是全部）蛋白质会经历不同类型的PTM，调节其活性、分子相互作用和细胞内位置1。在过多的PTM中，由无素蛋白家族、泛素本身和所有泛素样子介导，具有调节所有细胞内或部分细胞质蛋白2的潜力。因为它们本身是蛋白质，它们可以相互结合，形成不同拓扑的同质和异质链，每个与特定的调控函数2相关。需要工具来尝试破译和理解这个复杂的机器。世界各地的许多方法都是开发的，各有优缺点，在这里，我们提出了一种适合培养细胞的高性能方法。
该方法的主要优点是精度高。事实上，通过组合使用两个标记（6His和Flag）和两个步骤过程，分离修饰蛋白的纯度大大提高，因此它比单个标记融合Ub/Ubl3，4更具选择性。6His 标签的存在使纯化在完全变性条件下迈出了第一步，从而避免了任何含有泛素结合域的蛋白质或与泛素结合的其他蛋白质结合。这是一个技术问题，其他几个方法基于亲和纯化泛化蛋白酶使用特定抗体5或串联泛性结合元素（TUBEs）6。重要的是，这种技术没有偏向于对某种泛化的纯化，因为其他一些方法可能如此，因为单体和不同种类的多聚体被识别7。因此，一旦发现，泛化的变化将不得不更详细地研究标准生化方法，以确定所涉及的完全化的确切类型。
最后，该协议的另一个技术优势是使用慢病毒，它可以轻松快速地创建稳定的表达细胞系，具有合理的标记修饰剂表达水平，而不会干扰正常的细胞行为。
虽然泛化的一个重要作用是靶向蛋白进行蛋白体降解，但现在已知它具有许多其他调节特性，可能大多数细胞内或部分细胞内蛋白质1。这些功能的数量进一步增加与许多泛素像蛋白质的存在，形成一个蛋白质家族调节几乎每一个细胞机制1。它们的改变会对细胞生物学产生剧烈的影响，并可能导致或参与病理情况8，如癌症9。因此，需要工具来探索这一广阔的景观，并确定与病理学疾病相关的改变，可以作为新的治疗目标。
该协议专用于培养中的细胞，因为它们需要转导以表达外源标记 Ub/Ubl。一旦创建，这些稳定的细胞系可用于从 2D 或 3D 或异种移植培养物中生成 Ubl 轮廓，从而扩展可用于研究 PTM 轮廓的不同实验模型的视野。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们已经开发出一种强大而可靠的方法，用于生成由主要泛性家族成员修饰的蛋白质的配置文件。事实上，我们已经成功地应用了该协议，通过泛素、SUMO和Nedd8生成PTM的配置文件，并检测与治疗7相关的改变，以回应特定基因的过度表达或敲除（数据不显示）和在细胞中获得对各种化疗药物的耐药表型。
在操作程序过程中，操作者应小心的只是几个关键步骤?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了癌症癌症与HV和MS的La Ligue Contre le，以及ARC（癌症再癌症协会）到PS、INCa（国家癌症研究所）和癌症PACA到JI的支持。马赛蛋白质组学（marseille-proteomique.univ-amu.fr）的质谱设施，由IBISA（基础设施生物学圣特和阿格罗诺米）、Plateforme技术系统艾克斯-马赛、坎塞罗佩莱PACA、普罗旺斯-阿尔卑斯-阿尔特斯-阿祖尔大学支持格雷戈里翁、保利-卡尔梅特研究所和马赛研究中心。
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
Referências
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature’s escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).
- Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin. Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Matsumoto, M., et al. Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome. Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).
- Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins. Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).
- Bonacci, T., et al. Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).
- Hoeller, D., Dikic, I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy. Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).
- Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
