Профилирование убиквитин и убиквитин-подобных зависимых посттрансляционных модификаций и выявление значительных изменений
Summary
Этот протокол направлен на создание убиквитин (Ub) и убиквитин-лайков (Ubls) конкретных протеомов для выявления изменений такого рода посттрансляционных изменений (ПТМ), связанных с конкретным условием, таким как лечение или фенотип.
Abstract
Убиквитин (уб) и убиквитин-подобные (убл) зависимые посттрансляционные изменения белков играют фундаментальную биологическую регулятивную роль в клетке, контролируя стабильность белка, активность, взаимодействия и внутриклеточную локализацию. Они позволяют клетке реагировать на сигналы и адаптироваться к изменениям в ее среде. Изменения в этих механизмах могут привести к тяжелым патологическим ситуациям, таким как нейродегенеративные заболевания и раковые заболевания. Цель описанного здесь метода состоит в том, чтобы установить ub/ubls зависимые профили ПТМ, быстро и точно, от культивированных клеточных линий. Сравнение различных профилей, полученных из различных условий, позволяет выявить конкретные изменения, такие, как, например, те, которые были вызваны лечением. Лентивирная опосредованного клеточной трансдукции выполняется для создания стабильных клеточных линий, выражающих двухметки (6His и Флаг) версия модификатора (убиквитин или ubl, таких как SUMO1 или Nedd8). Эти метки позволяют очищать убиквитин и, следовательно, убиквитина белков из клеток. Это делается через двухэтапный процесс очистки: первый выполняется в условиях денатурации с использованием тега 6His, а второй в родных условиях с помощью тега Флага. Это приводит к высокоспецифической и чистой изоляции модифицированных белков, которые впоследствии идентифицируются и полуколичественно определяются жидкой хроматографией с последующей тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) технологии. Легкий анализ информатики данных MS с использованием программного обеспечения Excel позволяет создавать профили PTM, устраняя фоновые сигналы. Эти профили сравниваются между каждым условием для того, чтобы определить конкретные изменения, которые затем будут изучены более конкретно, начиная с их проверки стандартными методами биохимии.
Introduction
Предложенный здесь метод предназначен для изучения ПТМ при посредничестве членов семьи убиквитин из культивированных клеток млекопитающих, с тем чтобы определить потенциальные изменения, связанные с конкретным условием (лечение, дифференциация и т.д.). ПТМ представляют собой последний этап регуляции функций белков1. Действительно, когда-то производится переводного механизма, большинство, если не все белки проходят различные виды ПТМ, которые модулируют их активность, молекулярные взаимодействия, и внутриклеточного расположения1. Среди множества ПТМ являются те, опосредовано семьи убиквитин белков, убиквитин себя и все убиквитин-любит, имеют потенциал для регулирования всех внутриклеточных или частично цитоплазматических белков2. Потому что они сами белки, они могут быть сопряжены друг с другом, образуя однородные и неоднородные цепи различных топологий, каждый из которых связан с конкретными регулятивными функциями2. Инструменты необходимы, чтобы попытаться расшифровать и понять этот сложный механизм. Многие подходы были разработаны во всем мире, имея свои преимущества и недостатки, и здесь мы предлагаем один с высокой производительностью подходит для культивированных клеток.
Основным преимуществом этого метода является его точность. Действительно, чистота изолированных модифицированных белков значительно улучшилась за счет комбинаторного использования двух тегов (6His и Flag) и двух шагов-процедур, и поэтому он гораздо более избирательным, чем один тег слияния Ub/Ubl3,4. Наличие тега 6His позволяет первый шаг очистки в полностью денатурации состоянии тем самым избегая каких-либо совместной очистки белков, содержащих убиквитин связывания доменов или других белков, связывающихся с вездесущими. Это техническая проблема, с которой сталкиваются несколько других подходов, основанных на сродстве очистки убиквитинаированных протеомсов с использованием либо конкретных антител5 или тандема убиквитин связывающих элементов (TUBEs)6. Важно отметить, что этот метод не является предвзятым в пользу очищения определенного типа вездесущности, как это может быть в случае некоторых других подходов, так как как моно и различные виды полиубичинаций были определены7. Следовательно, как только будет установлено, что изменение убиквитинации должно быть изучено более подробно с помощью стандартных биохимических подходов, с тем чтобы определить точный вид убиквитина.
Наконец, еще одним техническим преимуществом этого протокола является использование лентивирусов, которые легко и быстро создают стабильные экспрессионные клеточные линии с разумным уровнем выражений помеченного модификатора, не мешая нормальному клеточному поведению.
В то время как одна важная роль повсеместновиления заключается в целевой белков для протеасомальной деградации, в настоящее время известно, что он имеет много других регуляторных свойств для потенциально наиболее внутриклеточных или частично внутриклеточных белков1. Количество этих функций еще больше усиливается существованием многих убиквитин, как белки, образуя семейство белков, регулирующих почти каждый клеточный механизм1. Их изменения могут иметь резкое влияние на биологию клеток и может привести или участвовать в патологических ситуациях8, таких как рак9. Таким образом, инструменты необходимы для изучения этого обширного ландшафта и определить изменения, связанные с патологическим состоянием, которое может служить в качестве новых терапевтических целей.
Этот протокол предназначен для клеток в культуре, так как они должны быть трансуктором, чтобы выразить экзогенные помечены Ub / Ubl. После создания эти стабильные клеточные линии могут быть использованы для генерации профилей Ubl из культуры в 2D или 3D или xenografts, тем самым расширяя горизонт различных экспериментальных моделей, которые могут быть применены для изучения профилей PTMs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали надежную и надежную методологию для генерации профилей белков, модифицированных основными членами семьи убиквитин. Действительно, мы успешно применили этот протокол для генерации профилей ПТМ по убиквитину, а также SUMO и Nedd8, а также для обнаружения изменений, связанных ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана La Ligue Contre ле Рак В. И. и MS, и АРК (ассоциация за ла recherche сюр-ле-рак) для PS, INCa (институт национального рака) и Canceropole PACA в JI. Объект масс-спектрометрии Марсель Протеомика (marseille-proteomique.univ-amu.fr) при поддержке IBISA (Инфраструктура Биология Санте и Агрономия), Plateforme Technologique Aix-Марсель, Канцеропеле PACA, Прованс-Альпы-Кот-д’Азур “Ригион”, Институт Паоли-Кальметтс и Центр Рехерче-ан-Кансьологи-де-Марсель.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
Referências
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature’s escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).
- Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin. Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Matsumoto, M., et al. Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome. Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).
- Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins. Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).
- Bonacci, T., et al. Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).
- Hoeller, D., Dikic, I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy. Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).
- Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
