Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative
Summary
Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.
Abstract
L’ubiquitina (ubiquitina) e le modifiche post-traduzionali dipendenti (ubl) delle proteine svolgono ruoli normativi biologici fondamentali all’interno della cellula controllando la stabilità delle proteine, l’attività, le interazioni e la localizzazione intracellulare. Consentono alla cellula di rispondere ai segnali e di adattarsi ai cambiamenti nel suo ambiente. Le alterazioni all’interno di questi meccanismi possono portare a gravi situazioni patologiche come le malattie neurodegenerative e i tumori. Lo scopo della tecnica qui descritta è quello di creare profili ptMs dipendenti ub/ubls, rapidamente e con precisione, da linee cellulari coltivate. Il confronto di diversi profili ottenuti da diverse condizioni consente l’identificazione di alterazioni specifiche, come quelle indotte ad esempio da un trattamento. La trasduzione cellulare mediata Lentiviral viene eseguita per creare linee cellulari stabili che esprimono una versione a due tag (6His e Flag) del modificatore (ubiquitina o un ubl come SUMO1 o Nedd8). Queste etichette permettono la purificazione dell’ubiquitina e quindi delle proteine ubiquitinate dalle cellule. Questa operazione viene eseguita tramite un processo di purificazione in due fasi: il primo viene eseguito in condizioni di defatura utilizzando il tag 6His e il secondo in condizioni native utilizzando il tag Flag. Ciò porta ad un isolamento altamente specifico e puro delle proteine modificate che vengono successivamente identificate e semi-quantificate dalla cromatografia liquida seguita dalla tecnologia di spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). La facile analisi informatica dei dati MS utilizzando il software Excel consente la creazione di profili PTM eliminando i segnali in background. Questi profili vengono confrontati tra ogni condizione al fine di identificare alterazioni specifiche che saranno poi studiate in modo più specifico, a partire dalla loro convalida mediante tecniche di biochimica standard.
Introduction
Il metodo qui proposto è dedicato allo studio dei PTM mediati dai membri della famiglia ubiquitina da cellule di mammiferi coltivati al fine di identificare potenziali alterazioni associate a una condizione specifica (trattamento, differenziazione, ecc.). I PTM rappresentano l’ultimo passo della regolazione delle funzioni delle proteine1. Infatti, una volta prodotte dalla macchina traslazionale, la maggior parte se non tutte le proteine subiscono diversi tipi di PTM che modulano la loro attività, interazioni molecolari e posizione intracellulare1. Tra le pletora di PTM sono quelli mediati dalla famiglia ubiquitina di proteine, ubiquitina stessa e tutti i tipi di ubiquitina, hanno il potenziale per regolare tutte le proteine intracellulari o parzialmente citoplasmate2. Poiché sono esse stesse proteine, possono essere coniugate tra loro, formando catene omogenee ed eterogenee di topologie diverse, ciascuna associata a specifiche funzioni normative2. Sono necessari strumenti per cercare di decifrare e comprendere questo complesso macchinario. Molti approcci sono stati sviluppati in tutto il mondo, con i propri vantaggi e svantaggi, e qui ne proponiamo uno con alte prestazioni adatte per le cellule coltivate.
Il vantaggio principale di questo metodo è la sua precisione. Infatti, la purezza delle proteine isolate modificate è altamente migliorata dall’uso combinatorio dei due tag (6His e Flag) e le due step-procedure e quindi è molto più selettiva di una fusione a singolo tag Ub/Ubl3,4. La presenza del 6His tag consente un primo passo di purificazione in una condizione di denatura completamente evitando così qualsiasi co-purificazione di proteine contenenti domini di legame dell’ubiquitina o altre proteine che si legano a quelle ubiquitinate. Si tratta di un problema tecnico riscontrato da diversi altri approcci basati sulla purificazione dell’affinità dei proteomi ubiquiturati utilizzando specifici anticorpi5 o elementi di legame dell’ubiquitina tandem (TUBEs)6. È importante sottolineare che questa tecnica non è di parte a favore della purificazione di un certo tipo di ubiquitinazione, come potrebbe essere il caso per alcuni altri approcci, dal momento che sia mono e diversi tipi di poliubiquitinations sono stati identificati7. Di conseguenza, una volta trovata, un’alterazione dell’ubiquitazione dovrà essere studiata in maggiori dettagli da approcci biochimici standard al fine di identificare il tipo esatto di ubiquitinazione coinvolto.
Infine, un altro vantaggio tecnico di questo protocollo è l’uso di lentivirus, che crea facilmente e rapidamente linee cellulari che esprimono stabili con ragionevole livello di espressioni di modificatore con tag senza interferire con il normale comportamento cellulare.
Mentre un ruolo importante dell’onniquitazione è quello di colpire le proteine per la degradazione proteasomica, è ora noto che ha molte altre proprietà regolatorie per le proteine potenzialmente più intracellulari o parzialmente intracellulari1. Il numero di queste funzioni è ulteriormente accresciuto dall’esistenza di molte ubiquitine come proteine, formando una famiglia di proteine che regolano quasi tutti i meccanismi cellulari1. Le loro alterazioni possono avere un impatto drastico sulla biologia cellulare e possono condurre o partecipare a situazioni patologiche8, come il cancro9. Quindi, sono necessari strumenti per esplorare questo vasto paesaggio e identificare le alterazioni associate a una condizione patologica che potrebbe servire come nuovi bersagli terapeutici.
Questo protocollo è dedicato alle cellule in coltura poiché devono essere trasdotte per esprimere Ub/Ubl esogeno. Una volta create, queste linee cellulari stabili possono essere utilizzate per generare profili Ubl dalla coltura in 2D o 3D o xenografts, estendendo così l’orizzonte dei diversi modelli sperimentali che possono essere applicati per studiare i profili PTMs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato una metodologia robusta e affidabile per generare profili di proteine modificate dai principali membri della famiglia ubiquitina. Infatti, abbiamo applicato con successo questo protocollo per generare profili di PTM da ubiquitina, e anche da SUMO e Nedd8, e per rilevare alterazioni associate a un trattamento7, in risposta alla sopra espressione o knockdown di un certo gene (dati non cellule che hanno acquisito un fenotipo resistente a diversi farmaci chemioterapici.
<p class…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da La Ligue Contre le Cancer a HV e MS, e l’ARC (associazione pour la recherche sur le cancer) a PS, INCa (istituto nazionale du cancro) e Canceropole PACA a JI. Lo strumento di spettrometria di massa della Proteomica di Marsiglia (marseille-proteomique.univ-amu.fr) sostenuto da IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, la Cola Cancéropàle PACA, la Provenza-Alpi-C Région, l’Institut Paoli-Calmettes e il Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
Referências
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