ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定
Summary
このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。
Abstract
ユビキチン(ub)およびユビキチン様(ubl)依存性タンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質の安定性、活性、相互作用、および細胞内局在を制御することにより、細胞内の基本的な生物学的調節的役割を果たします。それらは細胞が信号に応答し、環境の変化に適応することを可能にする。これらのメカニズム内の変更は、神経変性疾患や癌などの深刻な病理学的状況につながることができます。ここで説明する技術の目的は、培養細胞株からub/ubls依存PTMプロファイルを迅速かつ正確に確立することです。異なる条件から得られた異なるプロファイルの比較は、例えば治療によって誘発されるような特定の変化の同定を可能にする。レンチウイルス媒介細胞伝達は、修飾剤(ユビキチンまたはSUMO1またはNedd8のようなubl)の2タグ(6HisおよびFlag)バージョンを発現する安定な細胞株を作成するために行われる。これらのタグは、ユビキチンの精製を可能にし、したがって、細胞からのユビキチン化タンパク質の。これは 2 段階の精製プロセスを通じて行われます: 最初の 1 つは 6His タグを使用して変性状態で実行され、2 番目のタグは Flag タグを使用してネイティブ状態で実行されます。これは、その後、液体クロマトグラフィーによって同定され、半定量され、タンデム質量分析(LC-MS/MS)技術が続く、非常に特異的かつ純粋な修飾タンパク質の単離につながります。Excelソフトウェアを使用したMSデータの容易な情報分析により、バックグラウンド信号を排除することでPTMプロファイルの確立が可能になります。これらのプロファイルは、標準的な生化学技術による検証から始めて、より具体的に研究される特定の変化を識別するために、各条件間で比較されます。
Introduction
ここで提案される方法は、特定の状態(治療、分化など)に関連する潜在的な変化を同定するために、培養哺乳動物細胞からユビキチンファミリーメンバーによって媒介されるPTMを研究することに専念している。PTMはタンパク質の機能の調節の最後のステップを表す 1.実際、一度翻訳機械によって製造されると、ほとんどのタンパク質は、その活性、分子相互作用、および細胞内位置1を調節する異なる種類のPTMを受けるわけではない。PTMの多くは、タンパク質のユビキチンファミリーによって媒介されるもの、ユビキチン自体およびすべてのユビキチン様、細胞内または部分的に細胞質タンパク質2を調節する可能性を有する。それらはそれ自体がタンパク質であるため、互いに共役することができ、多様なトポロジの均質および異種鎖を形成し、それぞれが特定の調節機能に関連する2。この複雑な機械を解読し、理解するためには、ツールが必要です。多くのアプローチは、独自の長所と短所を持って、世界中で開発され、ここでは培養細胞に適した高性能なものを提案します。
この方法の主な利点は、その精度です。実際、単離された修飾タンパク質の純度は、2つのタグ(6HisとFlag)と2つのステップ手順の組み合わせ使用によって高度に改善され、したがって、単一のタグ融合Ub/Ubl3、4よりもはるかに選択的である。6Hisタグの存在は、完全変性状態での精製の第一段階を可能にし、それによってユビキチン結合ドメインまたはユビキチン化されたものに結合する他のタンパク質を含むタンパク質の共精製を回避する。これは、特異的抗体5またはタンデムユビキチン結合要素(TUBEs)6のいずれかを用いたユビキチン化プロテオームの親和性精製に基づく他のいくつかのアプローチによって遭遇する技術的問題である。重要なことに、この技術は、モノおよび異なる種類の多言語の両方が7を同定したので、いくつかの他のアプローチの場合と同様に、特定のタイプのユビキチン化の精製を支持するバイアスではない。したがって、いったん発見されると、ユビキチン化の変化は、関連するユビキチン化の正確な種類を特定するために、標準的な生化学的アプローチによってより詳細に検討されなければなりません。
最後に、このプロトコルのもう一つの技術的な利点は、レンチウイルスの使用であり、それは容易かつ迅速に、正常な細胞挙動を妨げることなく、タグ付き修飾剤の妥当なレベルの発現を有する安定した発現細胞株を作成する。
ユビキチン化の重要な役割の1つはプロテアソーム分解のためのタンパク質を標的とすることであるのに対し、潜在的に最も細胞内または部分的に細胞内タンパク質1に対する他の多くの調節特性を有することが知られている。これらの機能の数は、タンパク質のような多くのユビキチンの存在によってさらに増強され、ほぼすべての細胞機構を調節するタンパク質のファミリーを形成する1.彼らの改変は、細胞生物学に大きな影響を与える可能性があり、癌9のような病理学的状況8を導いたり、参加したりすることができる。したがって、ツールは、この広大な風景を探索し、新しい治療目標として役立つことができる病理学的状態に関連する変化を識別するために必要とされます。
このプロトコルは、励起タグ付き Ub/Ubl を発現するために伝達する必要があるため、培養中の細胞専用です。これらの安定した細胞株を作成すると、2Dまたは3Dまたは異種移植片の培養物からUblプロファイルを生成し、PTMプロファイルの研究に適用できるさまざまな実験モデルの地平線を拡張することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、主要なユビキチンファミリーメンバーによって修飾されたタンパク質のプロファイルを生成するための堅牢で信頼性の高い方法論を開発しました。実際、このプロトコルを適用して、ユビキチン、およびSUMOとNedd8によってPTMのプロファイルを生成し、特定の遺伝子の過剰発現またはノックダウンに応じて治療7に関連する変更を検出することに成功しました(デー?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、HVとMSにラ・リーグ・コントル・ル・ガン、ARC(協会はPS、INCa(国立デュガン研究所)とJIへのガノポールPACAに対して支援されました。IBISA(インフラ生物学サンテ・エ・アグロノミー)が支援するマルセイユ・プロテオミクス(marseille-proteomique.univ-amu.fr)、プレートフォルム・テクノロジー・エクス=マルセイユ、カンセロポールPACA、プロヴァンス=アルプ=コート・ダジュールレギオン、パオリ・カルメッテス美術館、レシェルシュ・アン・カンセロロジー・ド・マルセイユ美術館。
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
Referências
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature’s escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).
- Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin. Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Matsumoto, M., et al. Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome. Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).
- Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins. Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).
- Bonacci, T., et al. Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).
- Hoeller, D., Dikic, I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy. Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).
- Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
