Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen
Summary
Die Live-Bildgebung der lysosomalen Exozytose auf mikromusterten Zellen ermöglicht eine räumliche Quantifizierung dieses Prozesses. Morphologie-Normalisierung mit Mikromustern ist ein hervorragendes Werkzeug, um allgemeine Regeln über die räumliche Verteilung zellulärer Prozesse aufzudecken.
Abstract
Die Live-Bildgebung des pHluorin-markierten Soluble N-Ethylmaleimid-sensitive-Faktor Attachment-Proteins REceptor (v-SNARE) Vesicle-assoziiertes Membranprotein 7 (VAMP7) durch totale interne Reflexionfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ist eine einfache Möglichkeit, die Sekretion aus dem lysosomalen Fach zu erforschen. Unter Ausnutzung der Zellkultur auf mikrogemusterten Oberflächen, um die Zellform zu normalisieren, wurden eine Vielzahl statistischer Werkzeuge eingesetzt, um eine räumliche Analyse von sekretohierten Mustern durchzuführen. Mit Ripleys K-Funktion und einem statistischen Test basierend auf der nächsten Nachbarentfernung (NND) haben wir bestätigt, dass die Sekretion von Lysosomen kein zufälliger Prozess ist, sondern signifikante Clustering zeigt. Bemerkenswert erweise hat unsere Analyse ergeben, dass Exozytose-Ereignisse auch in Nonadhesionsbereichen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretole Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Dennoch haben wir festgestellt, dass die Zellhaftung das Clustering verbessert. Neben genau definierten Klebe- und Nicht-Klebstoffbereichen ermöglicht die kreisförmige Geometrie dieser Mikromuster die Verwendung von Polarkoordinaten und vereinfacht analysen. Wir verwendeten Kernel Density Estimation (KDE) und die kumulative Verteilungsfunktion auf Polarkoordinaten von Exozytoseereignissen, um angereicherte Bereiche der Exozytose zu identifizieren. In ringförmigen Mikromusterzellen kam es an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen zu Clustering. Unsere Analyse zeigt, wie statistische Werkzeuge eingesetzt werden können, um räumliche Verteilungen verschiedener biologischer Prozesse zu untersuchen.
Introduction
Exozytose ist ein universeller zellulärer Prozess, bei dem ein Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt und seinen Inhalt freisetzt. Das Vesikel kann entweder vollständig mit der Plasmamembran (Vollfusion) verschmelzen oder eine Fusionspore erzeugen, die während einer begrenzten Zeit offen bleibt (Kiss-and-Run)1. So werden beispielsweise neu synthetisierte Proteine aus Vesikeln, die aus dem Golgi-Komplex stammen, in das extrazelluläre Medium freigesetzt. Dieser biosynthetische, anterograde Weg ist vor allem bei mehrzelligen Organismen primordial, um Signalpeptide (z. B. Hormone, Neurotransmitter) und extrazelluläre Matrixkomponenten (z. B. Kollagen) sowie den Verkehr von Transmembranproteinen an die Plasmamembran zu sezernieren. Zusätzlich können Sekrete aus verschiedenen Endosomen auftreten: 1) Recycling von Endosomen zur Wiederverwendung von Transmembranproteinen; 2) mehrschichtige Körper (MVBs) zur Freisetzung von Exosomen; und 3) Lysosomen zur Freisetzung von proteolytischen Enzymen. Die endosomale Sekretion hat sich als wichtig für das Neuritenwachstum, die Pseudopodienbildung, die Plasmamembranreparatur und die ATP-abhängige Signalisierung2erwiesen.
Um die Exozytose auf Einzelzellebene zu untersuchen, wurden mehrere Techniken eingesetzt. Patch-Clamp ermöglicht die Detektion einzelner Exozytose-Ereignisse mit einer hohen zeitlichen Auflösung in einer Vielzahl von lebenden Zellen3. Diese Methode liefert jedoch keine Informationen über die Lokalisierung von Exozytose-Ereignissen, noch aus welchem Fach sie auftritt. Die Elektronenmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung exozytischer Ereignisse mit hoher räumlicher Auflösung und liefert in Kombination mit Der Immunolabeling Informationen über die Spezifität der beteiligten Kompartimente und Moleküle. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist der Mangel an Informationen über die Dynamik des Prozesses sowie seine Unfähigkeit, Hochdurchsatzstudien durchzuführen. Lichtmikroskopische Ansätze wie die totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM), die das evaneszierende Feld nutzt, um Fluorophore in der Nähe des Deckslips (100 nm) zu beleuchten, bieten eine gute zeitliche und räumliche Auflösung, um Exozytose-Ereignisse zu untersuchen. Diese Methode ist jedoch nur mit anhaftenden Zellen kompatibel und kann nur auf den ventralen/unteren Zellteil angewendet werden.
Bemerkenswert ist, dass die Plasmamembran eine signifikante Heterogenität auf der Grundlage von Klebstoffkomplexen aufzeigt, die nur in eingeschränkten Bereichen vorhanden sind. Diese Heterogenität schränkt z.B. die Aufnahme verschiedener Ligandenein 4. In ähnlicher Weise wurde kürzlich berichtet, dass die Sekretion aus dem Golgi-Komplex an “Hotspots” in der Plasmamembran5konzentriert ist. Darüber hinaus ist bekannt, dass bestimmte Ladungen durch fokaladad-assoziierte Exozytose6abgesondert werden. Daher sollte besonderes Augenmerk auf die Frage zu richten, ob Exozytoseereignisse zufällig im Weltraum verteilt sind oder ob sie auf bestimmte Bereiche der Plasmamembran konzentriert sind. Mehrere statistische Instrumente, die auf Ripleys K-Funktion basieren, wurden vorgeschlagen, um diese Fragen zu untersuchen7,8,9. Unser Ansatz kombiniert diese Werkzeuge mit Mikromusterung zur Steuerung der Zellform und der Heterogenität der Plasmamembran. Diese Technik bietet nicht nur die Möglichkeit, zwischen Klebstoff- und Nichtklebstoffbereichen zu unterscheiden, sondern ermöglicht auch den Vergleich zwischen verschiedenen Zellen und Bedingungen und erhöht die Leistungsfähigkeit statistischer Analysen.
Hier verwenden wir eine Vielzahl statistischer Werkzeuge, um die räumliche Verteilung von Exozytose-Ereignissen aus dem lysosomalen Fach zu untersuchen, das durch TIRFM-Livezellenbildgebung von VAMP7-pHluorin in ringförmigen mikromusternormalisierten hTert-RPE1-Zellen überwacht wird. Es wurde bestätigt, dass die Sekretion von Lysosomen kein zufälliger Prozessist 8,,9 und dass Exozytose-Ereignisse Clustering aufweisen. Bemerkenswert erweise gilt, dass Exozytose-Ereignisse auch in nicht-klebenden Bereichen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretore Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Dennoch hat die Zellhaftung das Clustering verbessert. Konsequenterweise identifizierte unsere Analyse angereicherte Bereiche der Exozytose, die sich an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen befanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir überwachten Exozytose-Ereignisse aus dem lysosomalen Fach durch TIRFM-Livezellbildgebung von VAMP7-pHluorin in ringförmigen mikromusternormalisierten Zellen und führten eine strenge statistische Analyse der räumlichen Parameter von Exozytoseereignissen durch. Unter Verwendung der transformierten Ripley-Funktion K und eines statistischen Tests auf der Grundlage der nächsten Nachbardistanz bestätigten wir, dass die Sekretion von Lysosomen kein zuzufälliger Prozess ist8,<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würdigen Thierry Galli (Center of Psychiatry and Neurosciences, INSERM) für die Bereitstellung des VAMP7-pHluorin-Plasmids. Wir danken Tarn Duong für die Beratung zur statistischen Analyse und den Mitgliedern des GOUD-Labors für fruchtbare Diskussionen. Die Autoren würdigen die Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg und PICT-IBiSA @Pasteur) und das Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), Mitglied der französischen Nationalen Forschungsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. wurde von der Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) unterstützt und P.M. erhielt Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skodowska-Curie-Zuschussvereinbarung Nr. 666003. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), dem Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) und Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) sowie dem Centre National de la Recherche Scientifique und Institut.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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