Quantificando parâmetros espáteris de exocitose celular em células micropatteradas
Summary
A imagem viva da excitose lisosômica em células micropatteradas permite uma quantificação espacial desse processo. A normalização da morfologia usando micropatterns é uma excelente ferramenta para descobrir regras gerais sobre a distribuição espacial dos processos celulares.
Abstract
Imagem ao vivo da pHluorin marcada como fator solúvel N-ethylmaleimida-fator anexo Proteína de apego REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana associada à vesícula 7 (VAMP7) por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) é uma maneira simples de explorar a secreção do compartimento lysosomal. Aproveitando a cultura celular em superfícies micropatteradas para normalizar a forma celular, uma variedade de ferramentas estatísticas foram empregadas para realizar uma análise espacial de padrões secretos. Usando a função K de Ripley e um teste estatístico baseado na distância do vizinho mais próximo (NND), confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório, mas mostra agrupamento significativo. Note-se que nossa análise revelou que os eventos de exocitose também estão agrupados em áreas de não adesão, indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. Ainda assim, descobrimos que a adesão celular aumenta o agrupamento. Além das áreas adesivas e não adesivas precisamente definidas, a geometria circular desses micropatterns permite o uso de coordenadas polares, simplificando as análises. Utilizamos a Estimativa de Densidade do Kernel (KDE) e a função de distribuição cumulativa em coordenadas polares de eventos de exocitose para identificar áreas enriquecidas de exocitose. Em células de micropattern em forma de anel, o agrupamento ocorreu na borda entre as áreas adesivas e não adesivas. Nossa análise ilustra como ferramentas estatísticas podem ser empregadas para investigar distribuições espaciais de diversos processos biológicos.
Introduction
Exocitose é um processo celular universal no qual uma vesícula se funde com a membrana plasmática e libera seu conteúdo. A vesícula pode se fundir totalmente com a membrana plasmática (fusão total) ou criar um poro de fusão que permanece aberto durante um tempo limitado (beijo-e-corrida)1. Por exemplo, proteínas recém-sintetizadas são liberadas no meio extracelular a partir de vesículas provenientes do complexo golgi. Este caminho biossintético, anterograde é primordial, especialmente em organismos multicelulares, para segregar peptídeos de sinalização (por exemplo, hormônios, neurotransmissores) e componentes de matriz extracelular (por exemplo, colágeno), bem como para traficar proteínas transmembranas para a membrana plasmática. Além disso, secreções podem ocorrer a partir de diferentes endossóis: 1) reciclagem de endósmosos a fim de reutilizar proteínas transmembranas; 2) corpos multivesiculares (MVBs) para liberação de exosóis; e 3) lysososomes para a liberação de enzimas proteolíticas. A secreção endossomal tem se mostrado importante para o crescimento de neurite, formação de pseudopodia, reparação da membrana plasmática e sinalização dependente de ATP2.
Para estudar a exocitese no nível de célula única, várias técnicas foram empregadas. Patch-clamp permite a detecção de eventos de exocitose única com uma alta resolução temporal em uma grande variedade de células vivas3. No entanto, este método não fornece informações sobre a localização de eventos de exocistose, nem de qual compartimento ocorre. A microscopia eletrônica permite a visualização direta de eventos exocióticos com alta resolução espacial, e em combinação com o imunolabeling fornece informações sobre a especificidade dos compartimentos e moléculas envolvidas. Uma desvantagem dessa abordagem é a falta de informação sobre a dinâmica do processo, bem como sua incapacidade de realizar estudos de alto rendimento. A microscopia leve, como a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM), que explora o campo evanescente para iluminar fluoroforos nas proximidades do deslizamento de cobertura (100 nm), proporciona boa resolução temporal e espacial para estudar eventos de exocistose. No entanto, este método só é compatível com células aderentes e só pode ser aplicado na parte ventral/inferior das células.
Note-se que a membrana plasmática revela heterogeneidade significativa baseada em complexos adesivos que estão presentes apenas em áreas restritas. Essa heterogeneidade restringe, por exemplo, a absorção de diferentes ligantes4. Da mesma forma, foi recentemente relatado que a secreção do complexo golgi está concentrada em “pontos quentes” na membrana plasmática5. Além disso, sabe-se que certas cargas são secretadas através da exocistose focal associada à adesão6. Assim, deve-se prestar atenção especial à questão de saber se os eventos de exocitose são distribuídos aleatoriamente no espaço, ou se estão concentrados em áreas específicas da membrana plasmática. Várias ferramentas estatísticas baseadas na função K de Ripley foram propostas para explorar essas questões7,,8,,9. Nossa abordagem combina essas ferramentas com micropatterning para controlar a forma celular e heterogeneidade da membrana plasmática. Além de fornecer um meio de distinguir entre áreas adesivas e não adesivas, essa técnica também permite a comparação entre diferentes células e condições e aumenta o poder das análises estatísticas.
Aqui utilizamos uma variedade de ferramentas estatísticas para estudar a distribuição espacial de eventos de excitose a partir do compartimento lisosômico monitorado por imagens de células vivas TIRFM de VAMP7-pHLuorin em células hTert-RPE1 em forma de anel. Foi confirmado que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório8,,9 e que eventos de exocitose exibem agrupamento. Note-se que os eventos de exocitose também estão agrupados em áreas não adesivas, indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. No entanto, a adesão celular melhorou o agrupamento. Consistentemente, nossa análise identificou áreas enriquecidas de exocitose que estavam localizadas na fronteira entre as áreas adesivas e não adesivas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monitoramos eventos de exocitose do compartimento lisosômico por tirfm imagem celular viva de VAMP7-pHluorin em células normalizadas em forma de anel e realizamos uma análise estatística rigorosa dos parâmetros espaciais dos eventos de excitose. Empregando a função K da Ripley transformada e um teste estatístico baseado na distância mais próxima do vizinho, confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório8,,9. Ambas as análise…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos muito Thierry Galli (Centro de Psiquiatria e Neurociências, INSERM) por fornecer o plasmídeo VAMP7-pHluorin. Agradecemos a Tarn Duong por conselhos sobre análise estatística e membros do laboratório goud por discussões frutíferas. Os autores reconhecem muito as Instalações de Imagem celular e tecidual (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg e PICT-IBiSA @Pasteur) e Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), membro da Infraestrutura Nacional de Pesquisa Francesa France-BioImaging (ANR10-INBS-04). A H.L. foi apoiada pela Associação pour la Recherche sur le Cancer (ARC) e a P.M. recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção de Marie Skłodowska-Curie nº 666003. Este trabalho foi apoiado por subvenções da INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), do Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) e Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), bem como o Centre National de la Recherche Scientifique e Institut Curie.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
Referências
- Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion “Hotspots” Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. . Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
