Cuantificación de parámetros espaciotemporales de la exocitostosis celular en células micropatr babeadas
Summary
Las imágenes en vivo de la exocitosis lisosomal en células micropatrnadas permiten una cuantificación espacial de este proceso. La normalización de la morfología utilizando micropatrón es una herramienta excepcional para descubrir reglas generales sobre la distribución espacial de los procesos celulares.
Abstract
Las imágenes en vivo de la proteína de membrana asociada al pHluorin etiquetada Soluble N-etillmaleimida-factor Accesorio REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana asociada al Vesículo 7 (VAMP7) por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) es una manera sencilla de explorar la secreción del compartimento lisosomal. Aprovechando el cultivo celular en superficies micropatrieras para normalizar la forma celular, se emplearon una variedad de herramientas estadísticas para realizar un análisis espacial de los patrones secretores. Usando la función K de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana (NND), confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio, sino que muestra clustering significativo. Cabe destacar que nuestro análisis reveló que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas de no adherencia, lo que indica que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Aún así, descubrimos que la adhesión celular mejora la agrupación en clústeres. Además de las áreas adhesivas y nodhesivas definidas con precisión, la geometría circular de estos micropatrón permite el uso de coordenadas polares, simplificando los análisis. Utilizamos la estimación de densidad de núcleo (KDE) y la función de distribución acumulativa en coordenadas polares de eventos de exocitosis para identificar áreas enriquecidas de exocitosis. En las células de micropatrón en forma de anillo, la agrupación se produjo en el borde entre las áreas adhesivas y nodhesivas. Nuestro análisis ilustra cómo se pueden emplear herramientas estadísticas para investigar las distribuciones espaciales de diversos procesos biológicos.
Introduction
La exocitosis es un proceso celular universal en el que una vesícula se fusiona con la membrana plasmática y libera su contenido. La vesícula puede fusionarse totalmente con la membrana plasmática (fusión completa) o crear un poro de fusión que permanece abierto durante un tiempo limitado (beso y carrera)1. Por ejemplo, las proteínas recién sintetizadas se liberan en el medio extracelular a partir de vesículas que provienen del complejo Golgi. Esta vía biosintética y anterograda es primordial, especialmente en organismos multicelulares, para secretar péptidos de señalización (por ejemplo, hormonas, neurotransmisores) y componentes de matriz extracelular (por ejemplo, colágeno), así como para traficar proteínas transmembranas a la membrana plasmática. Además, las secreciones pueden ocurrir de diferentes endosomas: 1) reciclar endosomas con el fin de reutilizar las proteínas transmembranas; 2) cuerpos multivesiculares (MVB) para liberar exosomas; y 3) lisosomas para la liberación de enzimas proteolíticas. Se ha demostrado que la secreción endosomal es importante para el crecimiento de la neurita, la formación de pseudopodias, la reparación de la membrana plasmática y la señalización dependiente de ATP2.
Para estudiar la exocitosis a nivel de una sola célula, se han empleado varias técnicas. Patch-clamp permite la detección de eventos de exocitosis individuales con una alta resolución temporal en una amplia variedad de células vivas3. Sin embargo, este método no proporciona información sobre la localización de eventos de exocitosis, ni desde qué compartimiento se produce. La microscopía electrónica permite la visualización directa de eventos excíticos con alta resolución espacial, y en combinación con el inmunoetiquetado proporciona información sobre la especificidad de los compartimentos y moléculas involucrados. Una desventaja de este enfoque es la falta de información sobre la dinámica del proceso, así como su incapacidad para realizar estudios de alto rendimiento. Los enfoques de microscopía ligera, como la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), que explota el campo evanescente para iluminar los fluoróforos en las proximidades del cubreobjetos (100 nm), proporciona una buena resolución temporal y espacial para estudiar eventos de exocitosis. Sin embargo, este método sólo es compatible con las células adherentes y sólo se puede aplicar a la parte ventral/inferior de las células.
Cabe destacar que la membrana plasmática revela una heterogeneidad significativa basada en complejos adhesivos que están presentes sólo en áreas restringidas. Esta heterogeneidad restringe, por ejemplo, la captación de diferentes ligandos4. Del mismo modo, recientemente se ha informado de que la secreción del complejo Golgi se concentra en “puntos calientes” en la membrana plasmática5. Además, se sabe que ciertas cargas se secretan a través de la exocitosis asociada a la adhesión focal6. Por lo tanto, se debe prestar especial atención a la cuestión de si los eventos de exocitosis se distribuyen aleatoriamente en el espacio, o si se concentran en áreas específicas de la membrana plasmática. Se han propuesto varias herramientas estadísticas basadas en la función K de Ripley para explorar estas preguntas7,,8,,9. Nuestro enfoque combina estas herramientas con micropatrón para controlar la forma celular y la heterogeneidad de la membrana plasmática. Además de proporcionar un medio para distinguir entre áreas adhesivas y no adhesivas, esta técnica también permite la comparación entre diferentes células y condiciones y aumenta el poder de los análisis estadísticos.
Aquí empleamos una variedad de herramientas estadísticas para estudiar la distribución espacial de eventos de exocitosis desde el compartimiento lisosomal monitoreado por imágenes de células vivas TIRFM de VAMP7-pHluorin en células hTert-RPE1 normalizadas en forma de anillo. Se confirmó que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio8,9 y que los eventos de exocitosis exhiben agrupación. Cabe destacar que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas no nadhesivas, lo que indica que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Sin embargo, la adhesión celular mejoró la agrupación en clústeres. Consistentemente, nuestro análisis identificó áreas enriquecidas de exocitosis que se encontraban en la frontera entre las áreas adhesivas y no nadhesivas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monitoreamos los eventos de exocitosis desde el compartimento lisosomal por imágenes de células vivas TIRFM de VAMP7-pHluorin en células normalizadas con micropatrón en forma de anillo y realizamos un análisis estadístico riguroso de los parámetros espaciales de los eventos de exocitosis. Empleando la función K transformada de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana, confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio8,,<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos mucho a Thierry Galli (Centro de Psiquiatría y Neurociencias, INSERM) por proporcionar el plásmido VAMP7-pHluorin. Agradecemos a Tarn Duong por el asesoramiento sobre análisis estadístico y a los miembros del laboratorio GOUD para debates fructíferos. Los autores reconocen en gran medida el Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg y PICT-IBiSA @Pasteur) y Nikon Imaging Center, Institut Curie (París), miembro de la France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. recibió el apoyo de la Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) y P.M. recibió financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Sk-odowska-Curie no 666003. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) e Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), así como el Centre National de la Rechecher Scientif y Curique Institut.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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