Mikro Desenli Hücrelerde Hücresel Eksositozun Spatiotemporal Parametrelerinin Ölçülmesi
Summary
Mikro desenli hücrelerde izosomal ekzositozun canlı görüntülemesi bu sürecin mekansal bir niceleifikasyonuna olanak sağlar. Mikro desenler kullanarak morfoloji normalleştirme hücresel süreçlerin mekansal dağılımı hakkında genel kuralları ortaya çıkarmak için olağanüstü bir araçtır.
Abstract
PHluorin etiketli Çözünür N-etilmaleimid-duyarlı faktör Ek protein ReEceptor (v-SNARE) Vezikül ilişkili membran protein 7 (VAMP7) toplam iç yansıma floresan mikroskop (TIRFM) tarafından canlı görüntüleme lisosomal bölmesi salgıyı keşfetmek için basit bir yoldur. Hücre şeklini normalleştirmek için mikro desenli yüzeylerdeki hücre kültüründen yararlanarak, salgı desenlerinin mekansal analizini yapmak için çeşitli istatistiksel araçlar kullanılmıştır. Ripley’in K fonksiyonunu ve en yakın komşu mesafesine (NND) dayalı istatistiksel bir test kullanarak, lizozomlardan salgılanmanın rastgele bir süreç olmadığını, ancak önemli kümelenmeler gösterdiğini doğruladık. Analizlerimiz eksozis olaylarının da yapışmaz bölgelerde kümelenmiş olduğunu ortaya çıkararak, plazma zarında salgılayıcı sıcak noktalara neden olabilecek tek yapının yapışma molekülleri olmadığını göstermektedir. Yine de, hücre yapışmanın kümeleme artırır bulundu. Tam olarak tanımlanmış yapışkan ve yapışkan olmayan alanlara ek olarak, bu mikro desenlerin dairesel geometrisi kutupsal koordinatların kullanılmasına olanak sağlar ve analizleri basitleştirir. Eksozisin zenginleştirilmiş alanlarını belirlemek için Çekirdek Yoğunluk Tahmini (KDE) ve eksozis olaylarının polar koordinatlarında kümülatif dağılım fonksiyonunu kullandık. Halka şeklindeki mikro desenli hücrelerde, yapıştırıcı ve yapışkan olmayan alanlar arasındaki sınırda kümelenme meydana geldi. Analizlerimiz, çeşitli biyolojik süreçlerin mekansal dağılımlarını araştırmak için istatistiksel araçların nasıl kullanılabildiğini göstermektedir.
Introduction
Eksozisoz, vezikülün plazma zarı ile kaynaşıp içeriğini serbest bıraktırdığı evrensel bir hücresel süreçtir. Vezikül ya plazma membran (tam füzyon) ile tamamen sigorta veya sınırlı bir süre boyunca açık kalır bir füzyon gözenek oluşturmak (kiss-and-run)1. Örneğin, yeni sentezlenen proteinler Golgi kompleksinden gelen veziküllerden hücre dışı ortama salınır. Bu biyosentetik, anterograd yolu ilkel, özellikle çok hücreli organizmalarda, sinyal peptidler salgılamak için (örneğin, hormonlar, nörotransmitterler) ve ekstrasellüler matriks bileşenleri (örneğin, kollajen), yanı sıra plazma membran trafik transmembran proteinleri. Ayrıca, salgıları farklı endozomlarda oluşabilir: 1) transmembran proteinleri yeniden kullanmak için geri dönüşüm endozoslar; 2) çok vezizküler cisimler (MVBs) ekzozomlar serbest bırakmak için; ve 3) proteolitik enzimlerin salınımı için lizozomlar. Endozomal salgının neurite büyüme, psödopodi oluşumu, plazma membran onarımı ve ATP’ye bağlı sinyalizasyon2için önemli olduğu gösterilmiştir.
Tek hücre düzeyinde eksofisoz çalışması için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Patch-clamp canlı hücrelerin geniş bir yelpazede yüksek zamansal çözünürlük ile tek eksozis olaylarının tespiti için izin verir3. Ancak, bu yöntem eksozis olaylarının yerelleştirilmesi veya hangi bölmeden oluştuğu hakkında bilgi sağlamaz. Elektron mikroskobu, ekszositik olayların yüksek uzamsal çözünürlükte doğrudan görüntülenmesine olanak sağlar ve immünetiketleme ile birlikte ilgili bölmelerin ve moleküllerin özgüllüğü hakkında bilgi sağlar. Bu yaklaşımın bir dezavantajı sürecin dinamikleri hakkında bilgi eksikliği yanı sıra yüksek iş itimat ları gerçekleştirmek için yetersizlik olduğunu. Coverslip (100 nm) civarındaki floroforları aydınlatmak için evanescent alanını kullanan total internal yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) gibi ışık mikroskobu yaklaşımları, eksositoz olaylarını incelemek için iyi zamansal ve mekansal çözünürlük sağlar. Ancak, bu yöntem sadece yapışık hücrelerle uyumludur ve sadece hücrelerin ventral/alt kısmına uygulanabilir.
Dikkat dikkat, plazma membran sadece kısıtlı alanlarda mevcut yapışkan kompleksleri dayalı önemli heterojenite ortaya koymaktadır. Bu heterojenlik, örneğin, farklı ligandsalımınıkısıtlar 4 . Benzer şekilde, son zamanlarda Golgi kompleksinden salgı plazma membran“sıcaknoktalar” 5 yoğunlaşmıştır bildirilmiştir. Ayrıca bazı kargoların fokal-yapışma ile ilişkili eksozitoz6ile salgılandırılan bilinmektedir. Bu nedenle eksositoz olaylarının uzayda rastgele dağılıp dağıtılmadığı veya plazma zarının belirli bölgelerinde yoğunlanıp yoğunlaşmadığı sorusuna özel bir dikkat edilmelidir. Ripley’s K fonksiyonudayalı çeşitli istatistiksel araçlar bu soruları keşfetmek için önerilmiştir7,8,9. Yaklaşımımız hücre şekli ve plazma membran heterojenliğini kontrol etmek için mikro desenleme ile bu araçları birleştirir. Yapışkan ve yapışkan olmayan alanları ayırt etmek için bir araç sağlamanın yanı sıra, bu teknik aynı zamanda farklı hücreler ve koşullar arasında karşılaştırma sağlar ve istatistiksel analizlerin gücünü artırır.
Burada, RING şekilli mikro desenli hTert-RPE1 hücrelerinde VAMP7-pHluorin’in TIRFM canlı hücre görüntülemesi ile izlenen lysosomal kompartmandan ekzositoz olaylarının mekansal dağılımını incelemek için çeşitli istatistiksel araçlar uyguluyoruz. Bu izozomlardan salgı rastgele bir süreç8,,9 değildir ve ekzositoz olayları kümelenme sergi doğrulandı. Eksozis olaylarının da adhesif olmayan bölgelerde kümelenmiş olduğunu ve adezyon moleküllerinin plazma zarında salgı layıcı sıcak noktalara neden olabilecek tek yapı olmadığını gördük. Yine de, hücre yapışması kümeleme geliştirmek yaptı. Analizlerimiz sürekli olarak yapışkan ve yapışkan olmayan bölgeler arasındaki sınırda bulunan zenginleştirilmiş eksofis alanları tespit etti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ring şeklindeki mikrodesen-normalleşmiş hücrelerde VAMP7-pHluorin’in TIRFM canlı hücre görüntülemesi ile lisozomal kompartmandan ekzositoz olaylarını izledik ve ekzositoz olaylarının uzamsal parametrelerinin titiz bir istatistiksel analizini yaptık. Dönüştürülmüş Ripley’s K fonksiyonu ve en yakın komşu mesafesine göre istatistiksel bir test istihdam, biz lizozomlardan salgı rastgele bir işlem8olmadığını doğruladı8 ,9. Her iki istat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz büyük ölçüde Thierry Galli (Psikiyatri ve Nörobilim merkezi, INSERM) VAMP7-pHluorin plazmid sağlamak için kabul. Tarn Duong’a istatistiksel analiz ler ve goud laboratuvarı üyeleri nezdinde ki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Yazarlar büyük ölçüde Hücre ve Doku Görüntüleme Tesisi (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg ve PICT-IBiSA @Pasteur) ve Nikon Görüntüleme Merkezi, Institut Curie (Paris), Fransız Ulusal Araştırma Altyapısı Fransa-BiyoGörüntüleme (ANR10-INBS-04) üyesi kabul. H.L. Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) tarafından desteklendi ve P.M. Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 666003 kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon aldı. Bu çalışma, INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) ve Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) yanı sıra Centre National de la Recherche Scientique and Curie’nin bağışları ile desteklenmiştir.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
Referências
- Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion “Hotspots” Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. . Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
