Количественная оценка спатиотемпоральных параметров клеточного экзоцитоза в микропаттернальных клетках
Summary
Прямая визуализация лизосомального экзоцитоза на микропаттернальных клетках позволяет пространственную количественную оценку этого процесса. Нормализация морфологии с использованием микропаттернов является выдающимся инструментом для выявления общих правил пространственного распределения клеточных процессов.
Abstract
Live изображения рГлуорин помечены растворимые N-этилмалеймид чувствительных факторов Присоединения белка REceptor (v-SNARE) Везикул-ассоциированный мембранный белок 7 (VAMP7) путем полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (TIRFM) является простой способ изучить секрецию из лизосомального отсека. Воспользовавшись клеточной культурой на микропаттернированных поверхностях для нормализации формы клеток, для выполнения пространственного анализа секреторных моделей были использованы различные статистические инструменты. Используя функцию K Рипли и статистический тест на основе ближайшего расстояния соседа (NND), мы подтвердили, что секреция от лизосом не является случайным процессом, но показывает значительную кластеризацию. Следует отметить, что наш анализ показал, что экзоцитозные события также группируются в неклезионных областях, что указывает на то, что молекулы адгезии не единственные структуры, которые могут вызвать секреторные горячие точки на плазменной мембране. Тем не менее, мы обнаружили, что деление клеток усиливает кластеризацию. Помимо четко определенных клеевых и неклейвых областей, круговая геометрия этих микропаттернов позволяет использовать полярные координаты, упрощая анализы. Мы использовали оценку плотности ядра (KDE) и кумулятивную функцию распределения полярных координат событий экзоцитоза для выявления обогащенных областей экзоцитоза. В кольцеобразных микропаттерновых клетках кластеризация происходила на границе между клеевыми и неклейными областями. Наш анализ показывает, как статистические инструменты могут быть использованы для исследования пространственного распределения различных биологических процессов.
Introduction
Экзоцитоз является универсальным клеточным процессом, в котором пузырьки сливаются с плазменной мембраной и высвобождает ее содержимое. Vesicle может либо предохранитель полностью с плазменной мембраны (полный синтез) или создать поры синтеза, который остается открытым в течение ограниченного времени (поцелуй изапустить) 1. Например, недавно синтезированные белки высвобождаются во внеклеточную среду из пузырьков, которые поступают из комплекса Golgi. Этот биосинтетический, антероградный путь изначальный, особенно в многоклеточных организмах, выделяет сигнальные пептиды (например, гормоны, нейротрансмиттеры) и внеклеточные матричные компоненты (например, коллаген), а также для движения трансмембранных белков в плазменную мембрану. Кроме того, выделения могут возникать из различных эндосом: 1) рециркуляции эндосом для повторного использования трансмембранных белков; 2) многозвуковые тела (MVB) для высвобождения экзосом; и 3) лизосомы для высвобождения протеолитических ферментов. Эндосомальная секреция была показана, чтобы быть важным для нейрита нарастания, псевдоподии формирования, плазменной мембраны ремонт, и АТФ-зависимыхсигнализации 2.
Для изучения экзоцитоза на уровне одной клетки, несколько методов были использованы. Патч-зажим позволяет обнаруживать одиночные события экзоцитоза с высоким временным разрешением в широком спектре живых клеток3. Однако этот метод не дает информации ни о локализации событий экзоцитоза, ни о том, из какого отсека он происходит. Электронная микроскопия позволяет напрямую визуализировать экзоцитные события с высоким пространственным разрешением, а в сочетании с иммунолабелированием предоставляет информацию о специфике задействованных отсеков и молекул. Недостатком такого подхода является отсутствие информации о динамике процесса, а также его неспособность проводить высокопутные исследования. Подходы световой микроскопии, такие как полная внутренняя флуоресцентная микроскопия отражения (TIRFM), которая использует эвакуационные поля для освещения флюорофоров в непосредственной близости от крышки (100 нм), обеспечивает хорошее временное и пространственное разрешение для изучения событий экзоцитоза. Однако этот метод совместим только с клетками-адептами и может применяться только к брюшной/нижней части клеток.
Следует отметить, что плазменная мембрана выявляет значительную неоднородность на основе клеевых комплексов, которые присутствуют только в ограниченных зонах. Эта неоднородность ограничивает, например, поглощение различных лигандов4. Кроме того, недавно было сообщено, что секреция из комплекса Golgi сосредоточена в “горячих точках” в плазменноймембране 5. Кроме того, известно, что некоторые грузы секретируются с помощью фокус-адгезии связанных экзоцитоз6. Таким образом, особое внимание следует уделить вопросу о том, случайным образом ли в пространстве распределяются события экзоцитоза, или же они сконцентрированы в определенных областях плазменной мембраны. Несколько статистических инструментов, основанных на функции K Рипли были предложены для изучения этихвопросов 7,8,9. Наш подход сочетает в себе эти инструменты с микропаттернированием для контроля формы клеток и неоднородности плазменной мембраны. Помимо предоставления средств для проведения различия между клеевыми и неклейными областями, этот метод также позволяет проводить сопоставления между различными клетками и условиями и увеличивает мощность статистического анализа.
Здесь мы используем различные статистические инструменты для изучения пространственного распределения событий экзоцитоза из лизосомального отсека, контролируемых живоклеточной визуализацией TIRFM VAMP7-pHluorin в кольцеобразных микропаттерн-нормализованных клетках hTert-RPE1. Было подтверждено, что секреция от лизосом неслучайный процесс 8,9 ичто экзоцитоз события демонстрируют кластеризации. Следует отметить, что события экзоцитоза также группируются в неклейвых областях, что указывает на то, что молекулы адгезии не единственные структуры, которые могут вызвать секреторные горячие точки на плазменной мембране. Тем не менее, деление клеток действительно усиливает кластеризацию. Последовательно наш анализ выявил обогащенные участки экзоцитоза, которые находились на границе между клеевыми и неклейными участками.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы отслеживали события экзоцитоза из лизосомального отсека с помощью живоклеточной визуализации TIRFM VAMP7-pHluorin в кольцеобразных микропаттерн-нормализованных клетках и проводили строгий статистический анализ пространственных параметров событий экзоцитоза. Используя преобразованную ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы высоко ценим Тьерри Галли (Центр психиатрии и неврологии, INSERM) за предоставление плазмид VAMP7-pHluorin. Мы благодарим Тарна Дуонга за консультации по статистическому анализу и членов лаборатории GOUD для плодотворных дискуссий. Авторы высоко признают клетки и ткани Imaging фонда (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg и PICT-IBiSA @Pasteur) и Nikon Imaging Center, Институт Кюри (Париж), член французской национальной исследовательской инфраструктуры Франции-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. была поддержана Ассоциацией за рак (ARC) и P.M. получила финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Мари Склодовска-Кюри No 666003. Эта работа была поддержана грантами INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) и Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), а также Национального центра научных исследований и института.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
Referências
- Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion “Hotspots” Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. . Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
