定量微模式细胞细胞外细胞异细胞的时态参数
Summary
在微模型细胞上对细胞外细胞的活成像允许这个过程的空间定量。使用微模式进行形态学规范化是揭示细胞过程空间分布的一般规则的杰出工具。
Abstract
通过总内部反射荧光显微镜（TIRFM）对pHluorin标记可溶性N-乙酰胺-敏感因子附件蛋白REceptor（V-SNARE）囊量相关膜蛋白7（VAMP7）进行实时成像，这是从溶酶体分泌物的一种简单方法。利用微模型表面的细胞培养来使细胞形状正常化，利用各种统计工具对分泌模式进行空间分析。使用 Ripley 的 K 函数和基于最近邻域距离 （NND） 的统计测试，我们确认来自裂酶体分泌不是随机过程，而是显示显著的聚类。值得注意的是，我们的分析显示，外细胞增多事件也聚集在非粘附区，表明粘附分子并不是能诱发血浆膜分泌热点的唯一结构。尽管如此，我们发现细胞粘附能增强聚类。除了精确定义的粘合剂和非粘性区域外，这些微模型的圆形几何形状允许使用极坐标，从而简化分析。我们使用内核密度估计（KDE）和外细胞病事件极坐标的累积分布函数来识别外细胞病的富集区。在环形微模式细胞中，聚类发生在粘合剂和非粘膜区域之间的边界。我们的分析说明了如何使用统计工具来调查不同生物过程的空间分布。
Introduction
外细胞增多是一种普遍的细胞过程，囊泡与血浆膜融合并释放其含量。囊泡可以完全与等离子膜（完全融合）融合，或创建一个融合孔，在有限的时间内保持开放（亲吻和运行）1。例如，新合成的蛋白质从来自高尔吉复合物的囊泡释放到细胞外介质中。这种生物合成，反极通路是原始的，特别是在多细胞生物体，分泌信号肽（如激素，神经递质）和细胞外基质成分（如胶原蛋白），以及交通跨膜蛋白到血浆膜。此外，分泌物可能来自不同的内膜：1） 回收内膜，以重复使用跨膜蛋白;2） 多体体（MMB）释放外体;3） 用于释放蛋白糖解酶的糖体。内染色体分泌已被证明对神经土菌生长、伪波迪亚形成、血浆膜修复和ATP依赖信号2非常重要。
为了研究单细胞水平的外细胞病，已经采用了几种技术。贴片夹允许在各种活细胞3中检测具有高时分辨率的单一外细胞病事件。但是，此方法不提供有关外细胞增多事件的定位信息，也不提供它发生的隔间的信息。电子显微镜允许以高空间分辨率直接可视化外细胞事件，并结合免疫标签提供有关所涉及的隔间和分子特异性的信息。这种方法的一个缺点是缺乏关于过程动态的信息，以及它无法进行高通量研究。光显微镜方法，如总内部反射荧光显微镜（TIRFM），利用消逝场照亮光泳在覆盖唇（100纳米）附近，为研究外细胞增多事件提供了良好的时间和空间分辨率。然而，这种方法只与粘附细胞兼容，只能应用于细胞的腹体/下同部分。
值得注意的是，等离子膜揭示了基于仅在限制区域存在的粘合复合物的显著异质性。这种异质性限制，例如，不同配体4的吸收。同样，最近有报道说，从高尔吉综合体分泌物集中在等离子膜5的”热点“。此外，众所周知，某些货物是通过焦粘附相关的外细胞增多6分泌的。因此，应特别注意外细胞增多事件是否随机分布在空间中，或者是否集中在血浆膜的特定区域。根据里普利的K函数，提出了几个统计工具来探讨这些问题7，8，9。,97,我们的方法将这些工具与微模式相结合，以控制细胞形状和等离子膜异质性。除了提供区分粘合剂和非粘性区域的方法外，该技术还允许对不同的细胞和条件进行比较，并增加统计分析的能力。
在这里，我们使用各种统计工具来研究由 TIRFM 活细胞成像 VAMP7-pHluorin 在环状微模式规范化 hTert-RPE1 细胞中监测的异细胞细胞学事件的空间分布。经证实，来自利索索姆的分泌物不是随机过程8,8，9，外细胞增多事件表现出聚类。值得注意的是，我们发现外细胞增多事件也聚集在非粘附区域，表明粘附分子并不是能诱发血浆膜分泌热点的唯一结构。然而，细胞粘附确实增强了聚类。一致地，我们的分析确定了位于粘合剂和非粘剂区域之间的边界的外细胞增多区域。
Protocol
Representative Results
Discussion
通过TIRFM活细胞成像VAMP7-pHluorin在环状微模式规范化细胞中监测出状细胞的外细胞细胞发生事件，对外细胞细胞事件的空间参数进行了严格的统计分析。使用转换的Ripley的K函数和基于最近邻域距离的统计测试，我们确认从裂酶体分泌不是一个随机过程,8，9。两项统计分析都令人信服地表明，外细胞增多事件表现出聚类（图2D和2G）。</st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们非常感谢蒂埃里·加利（精神病学和神经科学中心，INSERM）提供VAMP7-pHluorin质粒。我们感谢Tarn Duong就统计分析提供法律意见，并感谢高德实验室成员进行富有成果的讨论。作者非常肯定细胞和组织成像设施（PICT-IBiSA @Burg、PICT-EM @Burg 和 PICT-IBISA @Pasteur）和尼康成像中心，居里研究所（巴黎），法国国家研究基础设施法国-生物成像（ANR10-INBS-04）的成员。H.L.得到癌症治疗协会（ARC）的支持，根据玛丽·斯考多夫斯卡-库里赠款协议第666003号，P.M.从欧洲联盟的Horizon 2020研究和创新方案获得资助。这项工作得到了感染-ERA（ANR-14-IFEC-0002-04）、Labex CelTisPhyBio（ANR-10-LBX-0038）和伊德克斯巴黎科学与莱特雷斯（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）以及国家恢复科学中心和居里研究所的资助。
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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