ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

Summary

ここでは、細胞内の細胞骨格を撮影する上皮状の微小管細胞骨格を生細胞イメージングするためのプロトコルを説明し、物理的な力の変化に対する応答を監視する。

Abstract

細胞および組織レベルの成長と形態形成の調節を理解することは、何十年もの間、生物学的研究の最前線にありました。分子および画像技術の進歩により、生化学的シグナルが形態遺伝学的事象にどのような影響を与えるかについての洞察を得ることができました。しかし、生化学的シグナルとは別に、機械的手がかりも細胞および組織の成長のいくつかの側面に影響を与えることがますます明らかになっています。 シロイヌナズナは 、すべての地上臓器の生成を担当するドーム型の構造である。植物細胞における非製化セルロース沈着を媒介する皮質微小管細胞骨格の組織は、空間的に異なっている。セルロースは植物細胞壁の最も硬い成分であるため、細胞の細胞の生物学的性質を理解するためには、皮質微小管のパターンの視覚化と定量的評価が必要です。皮質微小管組織のステレオタイプ形態はまた、SAMに存在する組織全体の物理的な力の結果でもある。これらの物理的な力の摂動と皮質微小管組織のその後のモニタリングは、メカノ知覚および伝達の仲介に関与する候補タンパク質の同定を可能にする。ここでは、このようなプロセスを調査するのに役立つプロトコルについて説明します。

Introduction

植物細胞は、機械的にその機械的特性を動的に変化させることができる繊維強化複合材料に似た多糖類及び糖タンパク質の細胞外マトリックスに囲まれている^1。植物細胞の成長は、細胞への水の取り込みによって駆動され、細胞壁に引張力が蓄積する。このような力に応じて、細胞壁の物理的状態に対する変更は細胞の拡張を可能にする。一次壁を有する細胞は、主に多糖類の化学組成の違いにより細胞を含む二次細胞壁と比較して急速な成長を遂げることができる。一次壁細胞は、糖タンパク質に加えてセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、およびグリグニンを欠いて、二次細胞壁²に存在する成分から構成される。セルロースは、β-1,4結合を介して結合したグルコースポリマーであり、細胞壁の主要成分である。細胞増殖時に経験した高い引張力に耐えることができるフィブリラー構造に編成される^3.引張力に耐えるだけでなく、優先方向に沿った機械的補強は、セルロースマイクロフィブリルの正味方向に垂直な軸に沿ってターゴール駆動の膨張をもたらす。セルロースミクロフィブリルの組織は、皮質微小管細胞骨格の影響を受け、原形質膜⁴に位置するセルロース合成複合体の方向運動を導くようにする。したがって、蛍光分子と融合した微小管関連タンパク質または管状管を用いた皮質微小管組織をモニタリングすることは、植物細胞におけるセルロースの上層パターンの観察の代理となる役割を果たす。

皮質微小管細胞骨格のパターニングは、細胞および組織形態の制御下にある機械的な力を導く。皮質微小管組織は、SAMの頂点に位置する細胞に経時の優向組織を有していないが、一方、周囲およびSAMと新興器官の境界内の細胞は、皮質微小管⁵の安定した高度に組織化された超細胞アレイを有する。細胞の機械的状態を物理的に摂動させるいくつかのアプローチが開発されている。浸透圧状態の変化は、細胞壁の剛性に影響を与える薬理学的および酵素的化合物による治療と同様に^、細胞6,7が経験する引張力の後続の変化をもたらす可能性がある。組織が経験する圧縮力の漸進的増加を可能にする仕掛けの使用は、別の代替⁸である。遠心力の適用は、細胞⁹との物理的接触なしに機械的な力に影響を与えることも示されている。しかし、細胞群の指向性力を変化させる最も広く使用されている手段は、すべての表皮細胞が緊張下にあり、細胞の物理的なアブレーションが細胞のターゴール圧力を局所的に排除し、細胞間接着を破壊し、それによって隣接細胞が経験する引張力を改変するという事実を利用する。これは、高出力のパルス紫外線レーザーをターゲットにするか、細かい針を使用して行われます。

ここでは、SAMにおける機械的摂動に対する皮質微小管挙動のイメージングおよび評価のプロセスについて詳しく説明する。

Protocol

1. 植物の成長 シロイヌナズナズ種子は、緑色蛍光タンパク質(MBD-GFP)10と土壌上に融合した微小管結合ドメインを発現し、長い日(16時間日/8時間夜)、発芽のために1週間20°C/6°Cの条件で保持する。 発芽後、丈夫な栄養成長を可能にする十分な成長スペースを持つ新しいポットに苗を移す。植物を短い日(8時間日/16時間の夜)、20°C/16 °Cの条件で3〜5週間保ち…

Representative Results

図1は、ドームの中心に組織化されていない皮質微小管を含む細胞を有するMBD-GFP線から得られた典型的な投影画像と、周分布を有する周辺の細胞(図1A,B)を示す一方、境界ドメイン細胞には細胞の長い軸に平行に整列した皮状微小管が含まれている。これらの観察は、SAMの異なる領域における皮質微小管の空間分…

Discussion

メカノ知覚と伝達経路に関与する分子調節因子を特定するには、機械的信号伝達事象の評価が重要です。ここで説明するプロトコルは、シロイヌナズナズムのこのようなプロセスの読み出しとして皮質微小管応答を使用して、このような事象の定量的なビューを提供する。ここで説明する手順は、様々な組織タイプ^{16、17、18、19</…}

Materials

FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glycine	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
micropore tape	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
myo-inositol	Sigma	I5125
N6-benzyladenine	Sigma	B3408
nicotinic acid	Sigma	N4126
plastic hinged box	Electron microscopy sciences	64312
PPM (Plant Preservative Mixture)	Plant Cell Technology	PPM
Propidium iodide	Sigma	P4864
pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
thiamine hydrochloride	Sigma	T4625