Live Cell Imaging микротрубочек цитоскелет и микромеханические манипуляции Arabidopsis стрелять Apical Meristem
Summary
Здесь мы описываем протокол для живой клеточной визуализации цитоскелета корковых микротрубочек на съемках апического меристема и отслеживаем его реакцию на изменения в физических силах.
Abstract
Понимание регуляции роста и морфогенеза на уровне клеток и тканей находится на переднем крае биологических исследований на протяжении многих десятилетий. Достижения в области молекулярных и визуальных технологий позволили нам получить представление о том, как биохимические сигналы влияют на морфогенетические события. Тем не менее, становится все более очевидным, что помимо биохимических сигналов, механические сигналы также влияют на некоторые аспекты роста клеток и тканей. Arabidopsis стрелять апический меристем (SAM) является куполообразной структуры, ответственной за генерацию всех надземных органов. Организация цитоскелета корковых микротрубочек, который опосредует апопластическое осаждение целлюлозы в клетках растений, пространственно отличается. Визуализация и количественная оценка моделей корковых микротрубочек необходимы для понимания биофизической природы клеток в SAM, так как целлюлоза является самым жестким компонентом стенки клеток растения. Стереотипная форма организации корковых микротрубочек также является следствием тканевых физических сил, существующих на SAM. Возмущение этих физических сил и последующий мониторинг организации корковых микротрубочек позволяет идентифицировать кандидатские белки, участвующие в посредничестве механо-восприятия и трансдукции. Здесь мы описываем протокол, который помогает исследовать такие процессы.
Introduction
Растительные клетки окружены внеклеточной матрицей полисахаридов и гликопротеинов, которая механически напоминает волокно усиленного композитного материала, способного динамически изменять своимеханические свойства 1. Рост растительных клеток обусловлен поглощением воды в клетку, что приводит к сопутствующего наращиванию напряженных сил на клеточной стенке. В ответ на такие силы, изменения в физическом состоянии клеточной стенки позволяет расширение клеток. Клетки с первичными стенками способны претерпевать быстрый рост по сравнению со вторичной клеточной стеной, содержащей клетки, главным образом из-за различий в химическом составе полисахаридов внутри. Первичные клетки стенки состоят из целлюлозы, гемичеллозы и пектина в дополнение к гликопротеинам, и отсутствие лигнина, компонент, который присутствует во вторичной клеточнойстенке 2. Целлюлоза, глюкозный полимер, связанный β-1,4 связей, является основным компонентом клеточных стенок. Он организован в фибрилляльные структуры, которые способны выдерживать высокие напряженные силы, опытные во время роста клеток3. Помимо выдержив напряженные силы, механическое усиление по преференциальному направлению приводит к тургорному расширению вдоль оси перпендикулярно чистой ориентации микрофилибры целлюлозы. На организацию целлюлозных микрофиллятов влияет кортикальный цитоскелет микротрубочек, так как они направляют направленное движение целлюлозно-синтезующих комплексов, расположенных на плазменноймембране 4. Таким образом, мониторинг организации корковых микротрубочек с использованием микротрубочек, связанных с белком или тубулином, слитым с флуоресцентной молекулой, служит прокси для наблюдения за чрезмерной структурой целлюлозы в клетках растений.
Узор коркового микротрубокона цитоскелет находится под контролем клеток и ткани морфологии производных механических сил. Кортикальная организация микротрубочек не имеет какой-либо преференциальной организации с течением времени в клетках, расположенных на вершине SAM, в то время как клетки на периферии и граница между SAM и возникающим органом имеют стабильный, высокоорганизованный надклеточный массив корковых микротрубочек5. Было разработано несколько подходов к физическому возмущению механического состояния клеток. Изменения осмотического статуса, а также лечение фармакологическими и энзиматических соединений, которые влияют на жесткость клеточной стенки может привести к последующим изменениям в напряженных сил, с которымисталкиваются клетки 6,7. Использование приспособлений, которые позволяют постепенное увеличение сжатых сил, с которыми сталкиваются ткани является еще одной альтернативой8. Было также показано, что применение центробежных сил влияет на механические силы без физического контакта с клетками9. Тем не менее, наиболее широко используемые средства изменения направленных сил в группе клеток воспользоваться тем, что все эпидермальные клетки находятся под напряжением и физической абляции клеток позволит устранить тургорное давление локально, а также нарушение клетки к клетке адгезии, тем самым изменяя напряженные силы, с которыми сталкиваются соседние клетки. Это выполняется либо путем ориентации мощных импульсных ультрафиолетовых лазеров или с помощью тонкой иглы.
Здесь мы подробно о процессе визуализации и оценки поведения корковых микротрубочек для механического возмущения на SAM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оценка событий механической трансдукции сигнала имеет решающее значение для выявления молекулярных регуляторов, участвующих в механо-восприятии и трансдукционных путях. В описанном здесь протоколе содержится количественное представление о таких событиях с помощью кортикальной мик…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ни один.
Materials
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
Referências
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
