Live Cell Imaging von Microtubule Cytoskeleton und mikromechanische Manipulation der Arabidopsis Schießen apical Meristem
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Live-Zell-Bildgebung des kortikalen Mikrotubule-Zytoskeletts am triebförmigen Meristem und die Überwachung seiner Reaktion auf Veränderungen der physikalischen Kräfte.
Abstract
Das Verständnis der Regulierung von Wachstum und Morphogenese auf Zell- und Gewebeebene steht seit vielen Jahrzehnten an vorderster Front der biologischen Forschung. Fortschritte in molekularen und bildgebenden Technologien ermöglichten es uns, Einblicke zu gewinnen, wie biochemische Signale morphogenetische Ereignisse beeinflussen. Es wird jedoch immer deutlicher, dass neben biochemischen Signalen auch mechanische Hinweise mehrere Aspekte des Zell- und Gewebewachstums beeinflussen. Der Arabidopsis-Schieß-Apischer Meristem (SAM) ist eine kuppelförmige Struktur, die für die Erzeugung aller oberirdischen Organe verantwortlich ist. Die Organisation des kortikalen Mikrotubuli-Zytoskeletts, das apoplastische Zelluloseablagerungen in Pflanzenzellen vermittelt, ist räumlich unterschiedlich. Die Visualisierung und quantitative Bewertung von Mustern kortikaler Mikrotubuli ist notwendig, um die biophysikalische Natur von Zellen am SAM zu verstehen, da Zellulose die steifste Komponente der Pflanzenzellwand ist. Die stereotype Form der kortikalen Mikrotubuli-Organisation ist auch eine Folge der gewebeweiten physikalischen Kräfte, die am SAM vorhanden sind. Die Störung dieser physikalischen Kräfte und die anschließende Überwachung der kortikalen Mikrotubuli-Organisation ermöglicht die Identifizierung von Kandidatenproteinen, die an der Vermittlung von Mechano-Wahrnehmung und Transduktion beteiligt sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das hilft, solche Prozesse zu untersuchen.
Introduction
Pflanzenzellen sind von einer extrazellulären Matrix aus Polysacchariden und Glykoproteinen umgeben, die mechanisch einem faserverstärkten Verbundwerkstoff ähnelt, der seine mechanischen Eigenschaften dynamisch verändern kann1. Das Wachstum der Pflanzenzellen wird durch die Aufnahme von Wasser in die Zelle angetrieben, was zu einer gleichzeitigen Ansammlung von Zugkräften an der Zellwand führt. Als Reaktion auf solche Kräfte ermöglichen Modifikationen des physikalischen Zustands der Zellwand eine Zellexpansion. Zellen mit Primärwänden sind in der Lage, im Vergleich zu sekundären Zellwand enthaltenden Zellen ein schnelles Wachstum zu verzeichnen, hauptsächlich aufgrund von Unterschieden in der chemischen Zusammensetzung der Polysaccharide im Inneren. Primäre Wandzellen bestehen aus Cellulose, Hemicellulose und Pektin zusätzlich zu Glykoproteinen und fehlen Lignin, einer Komponente, die in der sekundären Zellwand2vorhanden ist. Cellulose, ein Glukosepolymer, das über β-1,4-Bindungen verbunden ist, ist der Hauptbestandteil der Zellwände. Es ist in fibrillare Strukturen organisiert, die in der Lage sind, hohen Zugkräften zu standzuhalten, die während des Zellwachstums erfahren werden3. Neben zugfesten Zugkräften führt die mechanische Verstärkung entlang einer bevorzugten Richtung zu einer turgorengetriebenen Ausdehnung entlang einer Achse senkrecht zur Netzausrichtung des Cellulose-Mikrofibrils. Die Organisation der Cellulose-Mikrofibrillen wird durch das kortikale Mikrotubuli-Zytoskelett beeinflusst, da sie die Richtungsbewegung der Cellulose-Synthesizing-Komplexe an der Plasmamembran4leiten. Daher dient die Überwachung der kortikalen Mikrotubuli-Organisation mit einem Mikrotubuli-assoziierten Protein oder Tubulin, das mit einem fluoreszierenden Molekül verschmolzen wird, als Proxy für die Beobachtung von darüber liegenden Mustern von Zellulose in Pflanzenzellen.
Die Musterung des kortikalen Mikrotubuli-Zytoskeletts ist unter der Kontrolle von Zell- und Gewebemorphologie abgeleiteten mechanischen Kräften. Kortikale Mikrotubuli-Organisation hat keine bevorzugte Organisation im Laufe der Zeit in Zellen, die sich an der Spitze des SAM befinden, während Zellen in der Peripherie und der Grenze zwischen dem SAM und dem entstehenden Organ eine stabile, hochorganisierte suprazelluläre Anordnung von kortikalen Mikrotubuli5haben. Es wurden mehrere Ansätze entwickelt, um den mechanischen Status der Zellen physisch zu stören. Veränderungen des osmotischen Status sowie die Behandlung mit pharmakologischen und enzymatischen Verbindungen, die die Steifigkeit der Zellwand beeinflussen, können zu nachträglichen Veränderungen der Zugkräfte der Zelle6,7führen. Die Verwendung von Kontraptionen, die eine allmähliche Zunahme der Druckkräfte durch Gewebe ermöglichen, ist eine weitere Alternative8. Die Anwendung von Fliehkräften hat auch gezeigt, dass die mechanischen Kräfte ohne physischen Kontakt mit den Zellenbeeinflussen 9. Die am weitesten verbreiteten Mittel zur Änderung der Richtungskräfte in einer Gruppe von Zellen nutzen jedoch die Tatsache, dass alle epidermalen Zellen unter Spannung stehen und die physikalische Ablation der Zellen den Turgorendruck lokal eliminiert und die Zell-zu-Zell-Adhäsion stört und dadurch die Zugkräfte der benachbarten Zellen verändert. Dies geschieht entweder durch gezieltes Targeting eines hochleistungsbetriebenen, gepulsten ULTRAviolettlasers oder mittels einer feinen Nadel.
Hier erarbeiten wir den Prozess der Bildgebung und Bewertung des kortikalen Mikrotubuli-Verhaltens für mechanische Störungen am SAM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bewertung mechanischer Signaltransduktionsereignisse ist entscheidend, um molekulare Regulatoren zu identifizieren, die an den Mechano-Wahrnehmungs- und Transduktionswegen beteiligt sind. Das hier beschriebene Protokoll bietet eine quantitative Ansicht solcher Ereignisse, indem die kortikale Mikrotubuli-Antwort als Auslesung für einen solchen Prozess in Arabidopsis-SAMs verwendet wird. Das hier beschriebene Verfahren wird routinemäßig in mehreren Studien an verschiedenen Gewebetypen16</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nichts.
Materials
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
Referências
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