Imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis

Summary

Qui descriviamo un protocollo per l’imaging a cellule vive del citoscheletro microtubulo corticale al meristem apicale shoot e monitoriamo la sua risposta ai cambiamenti nelle forze fisiche.

Abstract

Comprendere la regolazione a livello cellulare e tissutale della crescita e della morfogenesi è stato in prima linea nella ricerca biologica per molti decenni. I progressi nelle tecnologie molecolari e di imaging ci hanno permesso di ottenere informazioni su come i segnali biochimici influenzano gli eventi morfogenetici. Tuttavia, è sempre più evidente che oltre ai segnali biochimici, gli spunti meccanici hanno anche un impatto su diversi aspetti della crescita cellulare e tissutale. Il meristem apicale a scatto arabidopsis (SAM) è una struttura a forma di cupola responsabile della generazione di tutti gli organi fuori terra. L’organizzazione del citoscheletro microtubulo corticale che media la deposizione di cellulosa apoplastica nelle cellule vegetali è spazialmente distinta. La visualizzazione e la valutazione quantitativa dei modelli di microtubuli corticali sono necessarie per comprendere la natura biofisica delle cellule nel MAS, poiché la cellulosa è il componente più rigido della parete cellulare della pianta. La forma stereotipata dell’organizzazione dei microtubuli corticali è anche una conseguenza delle forze fisiche a livello tissutale esistenti al SAM. La perturbazione di queste forze fisiche e il successivo monitoraggio dell’organizzazione dei microtubuli corticali consentono l’identificazione delle proteine candidate coinvolte nella mediazione della meccano-percezione e della trasduzione. Qui descriviamo un protocollo che aiuta a indagare tali processi.

Introduction

Le cellule vegetali sono circondate da una matrice extracellulare di polisaccaridi e glicoproteine che assomiglia meccanicamente a un materiale composito rinforzato con fibre in grado di cambiare dinamicamente le sue proprietà^{meccaniche 1}. La crescita delle cellule vegetali è guidata dall’assorbimento di acqua nella cellula, che si traduce in un accumulo concomitante di forze di trazione sulla parete cellulare. In risposta a tali forze, le modifiche allo stato fisico della parete cellulare consentono l’espansione cellulare. Le cellule con pareti primarie sono in grado di subire una rapida crescita rispetto alla parete cellulare secondaria contenente cellule principalmente a causa delle differenze nella composizione chimica dei polisaccaridi all’interno. Le cellule primarie della parete sono composte da cellulosa, emicellulosa e pectina oltre alle glicoproteine e mancano di lignina, un componente presente nella parete cellulare secondaria². La cellulosa, un polimero del glucosio collegato tramite β-1,4 legami, è il componente principale delle pareti cellulari. È organizzato in strutture fibrillari in grado di resistere ad alte forze di trazione sperimentate durante la crescita cellulare³. Oltre a resistere alle forze di trazione, il rinforzo meccanico lungo una direzione preferenziale si traduce in un’espansione guidata dal turgore lungo un asse perpendicolare all’orientamento netto della microfibrillazione di cellulosa. L’organizzazione delle microfibriche di cellulosa è influenzata dal citoscheletro microtubulo corticale, in quanto guidano il movimento direzionale dei complessi sintetizzati alla cellulosa situati nella membrana^{plasmatica 4}. Pertanto, il monitoraggio dell’organizzazione dei microtubuli corticali utilizzando una proteina associata a microtubuli o una tubulina fusa con una molecola fluorescente serve come proxy per l’osservazione di modelli sovrascritti di cellulosa nelle cellule vegetali.

La modelliatura del citoscheletro microtubulo corticale è sotto il controllo delle forze meccaniche derivate dalla morfologia cellulare e tissutale. L’organizzazione corticale dei microtubuli non ha alcuna organizzazione preferenziale nel tempo nelle cellule situate all’apice del MAS, mentre le cellule della periferia e il confine tra il SAM e l’organo emergente hanno una gamma supracellulare stabile e altamente organizzata di microtubuli corticali⁵. Sono stati sviluppati diversi approcci per perturbo fisicamente lo stato meccanico delle cellule. Modifiche allo stato osmotico, così come il trattamento con composti farmacologici ed enzimatici che influenzano la rigidità della parete cellulare possono comportare successivi cambiamenti nelle forze di trazione sperimentate dalla cellula^6,7. L’uso di aggeggi che consentono il graduale aumento delle forze di compressione sperimentate dai tessuti è un’altra^{alternativa 8}. L’applicazione di forze centrifughe ha anche dimostrato di influenzare le forze meccaniche senza alcun contatto fisico con le cellule⁹. Tuttavia, i mezzi più utilizzati per cambiare le forze direzionali in un gruppo di cellule sfruttano il fatto che tutte le cellule epidermiche sono sotto tensione e l’ablazione fisica delle cellule eliminerà la pressione del turgore localmente e interromperà l’adesione da cellula a cellula, modificando così le forze di trazione sperimentate dalle cellule vicine. Questo viene eseguito prendendo di mira un laser ultravioletto pulsato ad alta potenza o per mezzo di un ago fine.

Qui elaboriamo il processo di imaging e valutazione del comportamento corticale dei microtubuli per la perturbazione meccanica al SAM.

Protocol

1. Crescita delle piante Seminare semi arabidopsis che esprimono il dominio legante del microtubulo fuso con proteine fluorescenti verdi (MBD-GFP)10 sul terreno e conservare in una lunga giornata (16 ore al giorno / 8 h notte), 20 ° C / 6 ° C condizioni per 1 settimana per la germinazione. Dopo la germinazione, trasferire le piantine in nuovi vasi con spazio di crescita sufficiente per consentire una robusta crescita vegetativa. Conservare le piante in breve giorno (…

Representative Results

La figura 1 mostra le immagini di proiezione tipiche ottenute dalle linee MBD-GFP con celle al centro della cupola contenenti microtubuli corticali disorganizzati e celle alla periferia con distribuzione circonferenziale (Figura 1A,B), mentre le celle del dominio limite contengono microtubuli corticali allineati parallelamente all’asse lungo della cellula. Queste osservazioni mostrano differenze nella distribuzio…

Discussion

La valutazione degli eventi di trasduzione meccanica del segnale è fondamentale per identificare i regolatori molecolari coinvolti nelle vie meccano-percezione e trasduzione. Il protocollo qui descritto fornisce una visione quantitativa di tali eventi utilizzando la risposta corticale dei microtubuli come lettura per tale processo nei MAS Arabidopsis. La procedura qui descritta viene regolarmente utilizzata in diversi studi in vari tipi di^{tessuti 16,17,}…

Materials

FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glycine	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
micropore tape	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
myo-inositol	Sigma	I5125
N6-benzyladenine	Sigma	B3408
nicotinic acid	Sigma	N4126
plastic hinged box	Electron microscopy sciences	64312
PPM (Plant Preservative Mixture)	Plant Cell Technology	PPM
Propidium iodide	Sigma	P4864
pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
thiamine hydrochloride	Sigma	T4625