Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor live celbeeldvorming van de corticale microtubuliercytoskelet bij de shoot apicale meristem en het toezicht op de reactie op veranderingen in de fysieke krachten.
Abstract
Inzicht in cel- en weefselniveauregulatie van groei en morfogenese loopt al tientallen jaren voorop in biologisch onderzoek. Dankzij de vooruitgang in moleculaire en beeldvormende technologieën konden we inzicht krijgen in hoe biochemische signalen morfogenetische gebeurtenissen beïnvloeden. Het wordt echter steeds duidelijker dat naast biochemische signalen, mechanische signalen ook invloed hebben op verschillende aspecten van cel- en weefselgroei. Arabidopsis ontspruit apical meristem (SAM) is een koepel-vormige structuur verantwoordelijk voor de generatie van alle bovengrondse organen. De organisatie van het corticale microtubulicytoskelet dat apoplastische cellulosedepositie bemiddelt in plantencellen is ruimtelijk verschillend. Visualisatie en kwantitatieve beoordeling van patronen van corticale microtubuli zijn noodzakelijk voor het begrijpen van de biofysische aard van cellen in de SAM, omdat cellulose de stijfste component van de plantencelwand is. De stereotiepe vorm van corticale microtubuli organisatie is ook een gevolg van weefsel-brede fysieke krachten bestaande in de SAM. Verstoring van deze fysieke krachten en de daaropvolgende monitoring van corticale microtubuli organisatie maakt het mogelijk voor de identificatie van kandidaat-eiwitten die betrokken zijn bij het bemiddelen van mechano-perceptie en transductie. Hier beschrijven we een protocol dat helpt bij het onderzoeken van dergelijke processen.
Introduction
Plantencellen worden omgeven door een extracellulaire matrix van polysacchariden en glycoproteïnen die mechanisch lijkt op een vezelversterkt composietmateriaal dat zijn mechanische eigenschappen dynamisch kan veranderen1. De groei van plantencellen wordt gedreven door de opname van water in de cel, wat resulteert in een gelijktijdige opbouw van trekkrachten op de celwand. In reactie op dergelijke krachten, wijzigingen in de fysieke toestand van de celwand zorgt voor celuitzetting. Cellen met primaire wanden zijn in staat om een snelle groei te ondergaan in vergelijking met secundaire celwand met cellen voornamelijk als gevolg van verschillen in de chemische samenstelling van de polysaccharides binnen. Primaire wandcellen zijn samengesteld uit cellulose, hemicellulose en pectine in aanvulling op glycoproteïnen, en gebrek aan lignine, een component die aanwezig is in de secundaire celwand2. Cellulose, een glucosepolymeer dat via β-1,4-bindingen is gekoppeld, is de belangrijkste component van de celwanden. Het is georganiseerd in fibrillar structuren die bestand zijn tegen hoge trekkrachten ervaren tijdens celgroei3. Naast het weerstaan van trekkrachten, mechanische versterking langs een preferentiële richting resulteert in turgor-gedreven expansie langs een as loodrecht op de netto oriëntatie van de cellulose microfibril. De organisatie van de cellulose microfibrils wordt beïnvloed door het corticale microtubulicytoskelet, omdat ze de richtingsbeweging van de cellulosesynthese-synthetiserende complexen op het plasmamembraan4begeleiden. Daarom dient het monitoren van corticale microtubuli organisatie met behulp van een microtubuli-geassocieerd eiwit of tubuline versmolten met een fluorescerend molecuul als een proxy voor de observatie van bovenmatige patronen van cellulose in plantencellen.
De patronen van de corticale microtubulicytoskelet is onder de controle van cel- en weefselmorfologie afgeleide mechanische krachten. Corticale microtubuli organisatie heeft geen preferentiële organisatie na verloop van tijd in cellen gelegen aan de top van de SAM, terwijl cellen in de periferie en de grens tussen de SAM en het opkomende orgaan hebben een stabiele, zeer georganiseerde supracellulaire array van corticale microtubuli5. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om de mechanische status van de cellen fysiek te verstoren. Veranderingen in de osmotische status, evenals de behandeling met farmacologische en enzymatische verbindingen die de stijfheid van de celwand beïnvloeden, kunnen leiden tot latere veranderingen in de trekkrachten die door de cel6,7 wordenervaren . Het gebruik van constructies die het mogelijk maken voor de geleidelijke toename van de compressieve krachten ervaren door weefsels is een ander alternatief8. Toepassing van centrifugale krachten is ook aangetoond dat de mechanische krachten beïnvloeden zonder enig fysiek contact met de cellen9. Echter, de meest gebruikte middelen van het veranderen van directionele krachten in een groep cellen profiteren van het feit dat alle epidermale cellen onder spanning staan en fysieke ablatie van cellen zal elimineren turgor druk lokaal evenals verstoren cel-tot-cel hechting, waardoor het wijzigen van de trekkrachten ervaren door de naburige cellen. Dit wordt uitgevoerd door het richten van een high-powered gepulseerde ultraviolette laser of door middel van een fijne naald.
Hier gaan we dieper in op het proces van beeldvorming en het beoordelen van corticale microtubuli gedrag voor mechanische verstoring bij de SAM.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beoordeling van mechanische signaaltransductiegebeurtenissen is cruciaal om moleculaire regelgevers te identificeren die betrokken zijn bij de mechano-waarnemings- en transductietrajecten. Het hier beschreven protocol geeft een kwantitatief beeld van dergelijke gebeurtenissen door de corticale microtubulirespons te gebruiken als uitlezing voor een dergelijk proces in Arabidopsis SAMs. De hier beschreven procedure wordt routinematig gebruikt in verschillende studies in verschillende weefseltypen<sup class="xre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
Referências
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
