Live Cell Imaging af Microtubule Cytoskeleton og mikromekanisk manipulation af Arabidopsis Skyd Apical Meristem

Summary

Her beskriver vi en protokol for levende celle billeddannelse af kortikale mikrotubule cytoskeleton på skyde apical meristem og overvåge dens reaktion på ændringer i fysiske kræfter.

Abstract

Forståelse celle-og vævsniveau regulering af vækst og morfogenese har været på forkant med biologisk forskning i mange årtier. Fremskridt inden for molekylær- og billeddannelsesteknologier gav os mulighed for at få indsigt i, hvordan biokemiske signaler påvirker morfogenetiske hændelser. Men det er mere og mere tydeligt, at bortset fra biokemiske signaler, mekaniske signaler også påvirke flere aspekter af celle og væv vækst. Den Arabidopsis skyde apisk meristem (SAM) er en kuppel-formet struktur ansvarlig for generation af alle overjordiske organer. Organiseringen af det kortikale mikrotubule cytoskeletton, der formidler apoplastisk celluloseaflejring i planteceller, er rumligt adskilt. Visualisering og kvantitativ vurdering af mønstre af kortikale mikrotubuli er nødvendige for at forstå den biofysiske karakter af celler på SAM, som cellulose er den stiveste komponent i plantecellevæggen. Den stereotype form for kortikal mikrotubule organisation er også en konsekvens af væv-dækkende fysiske kræfter, der findes på SAM. Forstyrrelsen af disse fysiske kræfter og efterfølgende overvågning af kortikale mikrotubule organisation giver mulighed for identifikation af kandidat proteiner involveret i mægle mechano-perception og transduktion. Her beskriver vi en protokol, der hjælper med at undersøge sådanne processer.

Introduction

Planteceller er omgivet af en ekstracellulær matrix af polysaccharider og glycoproteiner, der mekanisk ligner et fiberforstærket kompositmateriale, der dynamisk kan ændre dets mekaniske egenskaber¹. Vækst i planteceller er drevet af optagelsen af vand i cellen, hvilket resulterer i en samtidig ophobning af trækkræfter på cellevæggen. Som reaktion på sådanne kræfter giver ændringer af cellevæggens fysiske tilstand mulighed for celleudvidelse. Celler med primære vægge er i stand til at gennemgå hurtig vækst i forhold til sekundære cellevæg, der indeholder celler, hovedsagelig på grund af forskelle i den kemiske sammensætning af polysacchariderne inden for. Primære vægceller er sammensat af cellulose, hemicellulose, og pektin ud over glycoproteiner, og mangler lignin, en komponent, der er til stede i den sekundære cellevæg². Cellulose, en glukose polymer forbundet via β-1,4 obligationer, er den vigtigste del af cellevæggene. Det er organiseret i fibrillar strukturer, der er i stand til at modstå høje trækkræfter oplevet under cellevækst³. Ud over at modstå trækkræfter resulterer mekanisk forstærkning langs en præferenceretning i turgor-drevet ekspansion langs en aks vinkelret på netretningen af cellulosemikrofibril. Organiseringen af cellulose mikrofibrils er påvirket af kortikale mikrotubule cytoskelet, da de guider retningsbestemt bevægelse af cellulose-syntetiserende komplekser placeret på plasmamembranen⁴. Derfor, overvågning kortikale mikrotubule organisation ved hjælp af en microtubule-associeret protein eller tubulin fusioneret med en fluorescerende molekyle tjener som en proxy for observation af overliggende mønstre af cellulose i planteceller.

Mønstret af det kortikale mikrotubule cytoskeleti er under kontrol af celle- og vævsmorfologi afledte mekaniske kræfter. Kortikal mikrotubule organisation ikke har nogen præferenceorganisation over tid i celler placeret på toppen af SAM, mens celler i periferien og grænsen mellem SAM og det nye organ har en stabil, velorganiseret supracellular vifte af kortikale mikrotubuli⁵. Flere tilgange er blevet udviklet til fysisk forstyrre den mekaniske status af cellerne. Ændringer i osmotisk status samt behandling med farmakologiske og enzymatiske forbindelser, der påvirker cellevæggens stivhed, kan resultere i efterfølgende ændringer i trækkræfterne, som celle⁶,^7oplever. Brugen af tingester, der giver mulighed for den gradvise stigning i trykkræfter opleves af væv er et andet alternativ⁸. Anvendelse af centrifugalkræfter har også vist sig at påvirke de mekaniske kræfter uden fysisk kontakt med cellerne⁹. Men de mest udbredte midler til at ændre retningsbestemte kræfter i en gruppe af celler drage fordel af det faktum, at alle epidermale celler er under spænding og fysisk ablation af celler vil fjerne turgor pres lokalt samt forstyrre celle-til-celle vedhæftning, og dermed ændre trækkræfter opleves af de omkringliggende celler. Dette udføres enten ved at målrette en høj-drevne pulserende ultraviolet laser eller ved hjælp af en fin nål.

Her uddyber vi processen med billeddannelse og vurdering af kortikal mikrotubule adfærd for mekanisk perturbation på SAM.

Protocol

1. Plantevækst So Arabidopsis frø udtrykker mikrotubule bindende domæne fusioneret med grønne fluorescerende protein (MBD-GFP)10 på jorden og holde i lang dag (16 h dag / 8 h nat), 20 °C/6 °C betingelser for 1 uge for spiring. Efter spiring overføres planter til nye potter med tilstrækkelig vækstplads til at muliggøre robust vegetativ vækst. Hold planter på kort dag (8 timer dag /16 h nat), 20 °C/16 °C betingelser for 3-5 uger. Overfør planter…

Representative Results

Figur 1 viser typiske projektionsbilleder fra MBD-GFP-linjer med celler i midten af kuplen, der indeholder uorganiserede kortikale mikrotubuli, og celler i periferien med en omkredsfordeling (Figur 1A,B), mens grænsedomænecellerne indeholder kortikale mikrotubuli, der er justeret parallelt med cellens lange akse. Disse observationer viser forskelle i den rumlige fordeling af kortikale mikrotubuli i sam’ens fors…

Discussion

Vurderingen af mekaniske signaltransduktionshændelser er afgørende for at identificere molekylære regulatorer, der er involveret i mechano-perception og transduktionsveje. Den protokol, der er beskrevet her, giver et kvantitativt billede af sådanne hændelser ved at bruge det kortikale mikrotubulerespons som en udlæsning for en sådan proces i Arabidopsis SAM’er. Den her beskrevne fremgangsmåde anvendes rutinemæssigt i flere undersøgelser i forskellige vævstyper^16,<sup…

Materials

FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glycine	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
micropore tape	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
myo-inositol	Sigma	I5125
N6-benzyladenine	Sigma	B3408
nicotinic acid	Sigma	N4126
plastic hinged box	Electron microscopy sciences	64312
PPM (Plant Preservative Mixture)	Plant Cell Technology	PPM
Propidium iodide	Sigma	P4864
pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
thiamine hydrochloride	Sigma	T4625