细胞细胞成像的微管细胞和微机械操作的 阿拉比多普西斯拍摄 阿皮克·梅里斯特姆
Summary
在这里，我们描述了一个协议，用于在拍摄时皮质微管细胞骨架的活细胞成像，并监测其对物理力变化的反应。
Abstract
了解细胞和组织水平对生长和形态的调控几十年来一直处于生物学研究的最前沿。分子和成像技术的进步使我们能够深入了解生化信号如何影响形态遗传事件。然而，越来越明显的是，除了生化信号，机械线索也影响细胞和组织生长的几个方面。 阿拉伯射枪（SAM） 是一个圆顶形状的结构，负责生成所有地上器官。在植物细胞中培养增生纤维素沉积的皮质微管细胞骨架的组织在空间上是截然不同的。皮质微管模式的可视化和定量评估对于理解SAM细胞的生物物理性质是必要的，因为纤维素是植物细胞壁最坚硬的成分。皮质显微管组织的陈规定型形式也是 SAM 中存在的组织范围物理力的结果。这些物理力的扰动和皮质微管组织的随后监测允许识别参与调解机械感知和转导的候选蛋白质。在这里，我们描述了一个帮助调查此类过程的协议。
Introduction
植物细胞被多糖和糖蛋白的细胞外基质包围，这些基质在机械上类似于一种纤维增强复合材料，能够动态地改变其机械性能1。植物细胞的生长是由水吸收到细胞中所推动的，这导致细胞壁上同时积聚的拉伸力。为了响应这种力，对细胞壁的物理状态的修改允许细胞膨胀。与含有细胞的二级细胞壁相比，具有原壁的细胞能够快速生长，这主要是由于其中多糖的化学成分不同。原发性壁细胞由纤维素、血脂素和果胶以及缺乏木质素组成，木质素存在于二级细胞壁2中。纤维素是一种通过β-1，4键连接的葡萄糖聚合物，是细胞壁的主要成分。它被组织成纤维结构，能够承受细胞生长3过程中经历的高拉伸力。除了承受拉伸力外，沿优先方向进行机械加固还会导致沿垂直于纤维素微纤维的净向轴的涡轮驱动膨胀。纤维素微纤维的组织受皮质微管细胞骨架的影响，因为它们引导位于血浆膜4的纤维素合成复合物的方向运动。因此，使用微管相关蛋白质或与荧光分子融合的块状蛋白监测皮质微管组织，可作为观察植物细胞中纤维素上表面模式的代理。
皮质微管细胞骨架的图案在细胞和组织形态衍生的机械力的控制之下。皮质微管组织在位于SAM顶点的细胞中没有任何优先组织，而处于外围的细胞和SAM与新兴器官之间的边界则有一个稳定、高度组织的皮质微管5的超细胞阵列。已经开发出几种方法来物理干扰细胞的机械状态。渗透状态的变化，以及对影响细胞壁刚度的药理和酶化合物的治疗，都可能导致细胞6，7经历的拉伸力的后续变化。使用允许组织经历的压缩力逐渐增加的装置是另一种选择。离心力的应用也被证明对机械力有影响，而与细胞9没有任何物理接触。然而，在一组细胞中改变定向力的最广泛使用的方法利用了以下事实：所有表皮细胞都在紧张状态，细胞的物理消融将消除局部的结节压力，并破坏细胞对细胞的粘附，从而改变相邻细胞经历的拉伸力。这通过瞄准高功率脉冲紫外激光或通过细针执行。
在这里，我们详细阐述了在SAM的机械扰动成像和评估皮质微管行为的过程。
Protocol
Representative Results
Discussion
机械信号转导事件的评估对于识别机械感知和转导通路所涉及的分子调节器至关重要。此处描述的协议通过使用皮层微图响应作为 Arabidopsis SAM 中此类过程的读出，提供了此类事件的定量视图。这里描述的程序经常用于各种组织类型16，17，18，19的多个研究。在所有组织类型中，微管各向异性显…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
没有。
Materials
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
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