미생물의 미세 관 세포 골격및 아라비도시스 촬영 Apical 메리스템의 미세 기계적 조작의 라이브 세포 이미징
Summary
여기서 우리는 촬영 에 피질 미세 투하 세포 골격의 살아있는 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명하고 물리적 인 힘의 변화에 대한 반응을 모니터링.
Abstract
성장과 형태 발생의 세포 및 조직 수준 조절을 이해하는 것은 수십 년 동안 생물학적 연구의 최전선에 있었습니다. 분자 및 이미징 기술의 발전으로 생화학 적 신호가 형태 유전학 적 사건에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻을 수있었습니다. 그러나 생화학 적 신호 외에도 기계적 단서가 세포 및 조직 성장의 여러 측면에 영향을 미친다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다. 아라비도시스 는 모든 지상 장기의 생성을 담당하는 돔 모양의 구조입니다. 식물 세포에서 아포가소성 셀룰로오스 증착을 중재하는 피질 미세 투덜유 세포 골격의 조직은 공간적으로 구별된다. 셀룰로오스는 식물 세포벽의 가장 단단한 성분이기 때문에 피질 마이크로투블러의 패턴의 시각화 및 정량적 평가가 SAM에서 세포의 생물물리학적 특성을 이해하는 데 필요합니다. 피질 마이크로투룰 조직의 고정관형 형태는 SAM에 존재하는 조직 전체의 물리적 힘의 결과이기도 합니다. 이러한 물리적 힘의 왜곡과 피질 마이크로 투튜브 조직의 후속 모니터링은 메카노 지각 및 트랜스포메이션을 중재하는 데 관련된 후보 단백질의 식별을 가능하게 합니다. 여기에서는 이러한 프로세스를 조사하는 데 도움이 되는 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
식물 세포는 기계적으로 기계적 으로 변경할 수있는 섬유 강화 복합 재료와 유사한 다당류및 당단백질의 세포외 매트릭스에 의해포위된다 1. 식물 세포의 성장은 세포로 물의 섭취에 의해 구동되며, 이는 세포 벽에 인장력의 수반되는 축적을 초래합니다. 이러한 힘에 대응하여 세포벽의 물리적 상태를 수정하면 세포 팽창이 가능합니다. 1차 벽을 가진 세포는 주로 내다당류의 화학적 조성의 차이로 인해 세포를 포함하는 이차 세포벽에 비해 급속한 성장을 이룰 수 있다. 1차 벽세포는 당단백질 이외에 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴으로 구성되며, 이차 세포벽2에존재하는 성분인 리그닌이 결여된다. 셀룰로오스, β-1,4 결합을 통해 연결 된 포도 당 고분자, 세포벽의 주요 구성 요소. 세포 성장3에서 경험된 높은 인장력을 견딜 수 있는 세브릴라 구조로 구성됩니다. 인장력을 견딜 뿐만 아니라, 우대 방향을 따라 기계적 보강은 셀룰로오스 마이크로피브릴의 순 방향에 수직인 축을 따라 터고 구동 팽창을 초래한다. 셀룰로오스 마이크로피브릴의 조직은 혈장 막4에위치한 셀룰로오스 합성 복합체의 방향 이동을 안내하기 때문에 피질 미세 투덜어 사이토스켈레톤에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 형광 분자와 융합된 마이크로투룰관련 단백질 또는 튜룰린을 이용한 피질 마이크로투룰 조직을 모니터링하는 것은 식물 세포에서 셀룰로오스의 과열 패턴을 관찰하기 위한 프록시역할을 한다.
피질 미세 투하 세포 골격의 패터닝은 세포 및 조직 형태 유래 기계적 힘의 통제 하에 있다. 피질 마이크로튜버 조직은 SAM의 정점에 위치한 세포에서 시간이 지남에 따라 어떤 우대 조직이 없는 반면, 주변의 세포와 SAM과 신흥 기관 사이의 경계는 피질 마이크로튜브5의안정적이고 고도로 조직된 수퍼셀룰러 배열을 갖는다. 몇몇 접근은 세포의 기계적 상태를 물리적으로 왜곡하기 위하여 개발되었습니다. 삼투성 상태에 대한 변화뿐만 아니라 세포벽의 강성에 영향을 미치는 약리학적 및 효소 화합물로 치료하는 것은 세포 에 의해 경험된 인장력의 후속 변화를 초래할 수있다6,7. 조직에 의해 경험되는 압축력의 점진적 증가를 허용하는 진기한의 사용은 또 다른 대안8이다. 원심력의 적용은 또한세포(9)와의물리적 접촉 없이 기계적 힘에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러나, 세포의 그룹에서 방향력을 변화시키는 가장 널리 사용되는 수단은 모든 표피 세포가 세포의 장력 및 물리적 절제 하에 있다는 사실을 활용하여 로컬로 터고 압력을 제거하고 세포 대 세포 접착을 방해하여 이웃 세포에 의해 경험되는 인장력을 수정합니다. 이것은 고성능 펄스 자외선 레이저를 대상으로 하거나 미세 한 바늘을 통해 수행됩니다.
여기서 우리는 SAM에서 기계적 혼란을 위한 피질 미세 투벌 거동을 이미징하고 평가하는 과정에 대해 자세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기계 신호 변환 이벤트의 평가는 메카노 지각 및 트랜스듀션 경로에 관련된 분자 조절기를 식별하는 데 매우 중요합니다. 여기서 설명된 프로토콜은 아기도시스 SAM에서 이러한 프로세스에 대한 판독으로 피질 마이크로튜뮬 반응을 사용하여 이러한 이벤트에 대한 정량적 보기를 제공한다. 여기서 설명된절차는 다양한 조직유형(16, 17,18,<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
Referências
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