Summary
Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de procedure om colonoscopisch geleide knijpbiopten bij muizen te induceren en wondsluiting in realtime te volgen. Daarnaast zijn er methoden voor de bereiding van weefsels voor histologische, immunohistochemische en moleculaire analyses van het wondbed.
Abstract
Inzicht in het weefsel en de cellulaire veranderingen die optreden in de acute letselrespons en tijdens het wondgenezingsproces is van het grootste belang bij het bestuderen van ziekten van het maagdarmkanaal (GI). Het murine colonic pinch biopsiemodel is een nuttig hulpmiddel om deze processen te definiëren. Bovendien kan het samenspel tussen darmluminantiegehalte (bijv. microben) en de dikke darm worden bestudeerd. Wondinductie en het vermogen om wondsluiting na verloop van tijd op een betrouwbare manier te volgen, kunnen echter een uitdaging zijn. Bovendien moeten weefselvoorbereiding en -oriëntatie op een gestandaardiseerde manier worden uitgevoerd om histologic en moleculaire veranderingen optimaal te ondervragen. Hier presenteren we een gedetailleerde methode die biopsie-geïnduceerde verwonding en de monitoring van wondsluiting door herhaalde colonoscopieën beschrijft. Er wordt een aanpak beschreven die zorgt voor consistente en reproduceerbare metingen van de wondgrootte, het vermogen om het wondbed te verzamelen voor moleculaire analyses en het wondbed te visualiseren bij het doorsneden van weefsels. Het vermogen om deze technieken met succes uit te voeren maakt studies mogelijk van de acute letselrespons, wondgenezing en luminaal-gastheer interacties binnen de dikke darm.
Introduction
Het maagdarmkanaal (GI) is een complex orgaansysteem gezien zijn meerdere functies, gastheerceltypen (bijv. epitheel, immuun, stromale, enz.) evenals biljoenen microben. In het licht van deze complexiteit brengen ziekten van het GI-kanaal vaak het samenspel van al deze factoren met zich mee. Inflammatoire darmziekten (IBD) worden bijvoorbeeld geassocieerd met cycli van ontsteking en remissie in het GI-kanaal, waarbij ontstekingscellen worden geactiveerd, dysbiose en epitheelherstel1,2,3,4,5,6,7. Het hebben van geschikte modelsystemen om IBD en andere inflammatoire aandoeningen van het maagdarmkanaal te bestuderen, is van cruciaal belang voor het ophelderen van de pathogenese van de ziekte. Er bestaan verschillende modellen om IBD pathogenese te bestuderen, waaronder genetisch gemanipuleerde muizen en het gebruik van chemicaliën zoals dextran natriumsulfaat (DSS) bij knaagdieren8,9,10. Beperkingen van deze modellen omvatten een onvermogen om de inductie van ontstekingen nauwkeurig te beheersen, evenals moeilijkheden bij het evalueren van wondgenezing. Alternatieve methoden om aspecten van IBD-pathogenese na te bootsen, kunnen nuttig zijn voor het ontwikkelen van therapieën.
Colonoscopisch geleide pinch biopsieën bij muizen bieden een nuttig modelsysteem om de pathogenese van de ontstekingsreactie, wondgenezing en gastheer-microbe-interacties in de dikke darm te bestuderen. Deze aanpak werd voor het eerst gebruikt als een experimenteel hulpmiddel in 2009, dat zijn nut aantoonde voor het bestuderen van de acute ontstekingsreactie en wondgenezing in dedarmen 11. Latere studies gebruikten deze techniek om de rollen van verschillende signaleringsroutes en de darmmicrobiota te evalueren, in colonische wondgenezing11,12,13,14,15,16,17,18. Meer recentelijk gebruikte onze groep dit model om het belang van sfingosine-1-fosfaatsignalering en bacteriën in de acute respons op darmletsel19te onderzoeken. Hoewel nuttig, kan het technisch uitdagend zijn om colonoscopisch geleide knijpbiopten bij muizen uit te voeren en latere weefselveranderingen te evalueren. Perforatie van de darm kan bijvoorbeeld optreden bij inductie van letsel en het kan moeilijk zijn om consistente metingen van het wondbed door seriële colonoscopieën te garanderen. Bovendien kan het een uitdaging zijn om het colonweefsel goed te oriënteren om het wondbed te visualiseren voor histologische of immunohistochemische analyses. Hoewel er enige informatie bestaat over deze methoden18,20, belooft een nauwkeurige stapsgewijze beschrijving van deze technieken samen visuele hulpmiddelen om de betrouwbaarheid en het bredere nut van dit model te verbeteren. Hier presenteren we een gedetailleerde methode om colonoscopisch geleide knijpbiopsieën bij muizen uit te voeren, wondsluiting in de loop van de tijd te volgen en het weefsel voor te bereiden om histologic en moleculaire analyses van het wondbed mogelijk te maken. Het creëren van een standaardmethode om deze technieken uit te voeren kan het gebruik van dit model uitbreiden om eerder niet-onderzochte mediators te bestuderen die mogelijk belangrijk zijn voor GI-ontsteking en wondherstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Weill Cornell Medicine." Aan: "Alle hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Weill Cornell Medicine en Stony Brook University.
1. Colonoscopie en wondinductie
- Monteer de onderdelen van de endoscoop voor door eerst de 1,9 mm stijve boor endoscoop in de huls te steken (figuur 1A-B). Bevestig de luchtpomp (om colonische insufflering te bieden) met behulp van de meegeleverde slang aan de gasklep aan de linkerkant van de huls naast het werkkanaal (figuur 1C).
OPMERKING: Hoewel de hier beschreven lens 0° is, kan hiervoor ook een 30° lens worden gebruikt. - Zorg ervoor dat het werkkanaal in de open positie staat en steek 3 Fr biopsie forceps door het werkkanaal en ga verder tot het einde van de schede (terwijl u ervoor zorgt dat het niet uit de huls steekt) (Figuur 1C). Bevestig de geassembleerde endoscoop volgens de instructies van de fabrikant aan de lichtbron en het videobeeldapparaat.
- Verdoof de muis met 5% isofluraan met zuurstof in een inductiekamer. Beweeg vervolgens de muis naar een endoscopisch faseringsplatform met een verwarmingssysteem (om onderkoeling te voorkomen) aan de ventrale kant en houd onder narcose met behulp van een neuskegel met 2% isofluraan met zuurstof. Voeg dierenartszalf toe aan de ogen om droogheid tijdens anesthesie te voorkomen. Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is door voorzichtig in de achtervoet te knijpen om te testen op een reflex.
OPMERKING: Elke stam of elk geslacht van muizen kan met deze techniek worden gebruikt; het verdient echter de voorkeur dat muizen ten minste 8 weken oud zijn, dus ze zijn groot genoeg voor de procedure.- Voeg dierenartszalf toe aan de ogen om droogheid tijdens anesthesie te voorkomen.
- Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is door voorzichtig in de achtervoet te knijpen om te testen op een reflex.
- Vul een spuit van 3 ml met een bijgevoegde rattengavagenaald met zoutoplossing (PBS) met kamertemperatuurfosfaatbuffering. Steek de naald ongeveer 1 cm in de anus van de muis en doordrenk PBS voorzichtig om fecaal materiaal te verwijderen. Verschillende fecale pellets moeten de muis verlaten samen met de PBS die is geïnfuseerd.
OPMERKING: Instillatie van een overmatig volume PBS kan leiden tot schuimvorming in het lumen die het zicht op het lumen kan verduisteren. - Steek de geassembleerde endoscoop 0,5 cm in de anus van de muis. Schuif de biopsiekracht in het lumen van het rectum totdat de volledige 'kaken' (inclusief scharnier) van de tang voorbij het einde van de schede zijn (zoals waargenomen op de videomonitor) (Aanvullende video 1). Draai de tang 90° zodat de kaken in een oost-west oriëntatie opengaan (Aanvullende Video 1).
- Om te biopsie, open de tang en ga ongeveer 1 cm vooruit, sluit de tang en trek in één vloeiende beweging snel terug op de tang terwijl u ze gesloten laat(Aanvullende video 1).
- Vermijd het volledig insuffleren van de dikke darm bij het uitvoeren van de biopsie. Laat daarom de rechterkant van de gasklep tijdens deze stap open; hoewel opgemerkt moet worden dat bij het openen van de tang het risico bestaat dat het slijmvlies wordt beschadigd wanneer de dikke darm zich in deze positie bevindt.
2. Visualiseren en meten van het wondbed
- Start de video-opname onmiddellijk na de biopsie door op het voetpedaal te drukken dat aan het colonoscoopopnameapparaat is bevestigd. Sluit de dikke darm volledig in door stevig op een wijsvinger tegen de rechterkant van de gasklep te drukken om de opening volledig te bedekken om de lucht in de endoscoop en dus in de dikke darm te dwingen.
OPMERKING: Hoewel dit protocol het gebruik van een luchtpomp beschrijft waarin de luchtstroom handmatig wordt geregeld, kan ook een peristaltische pomp met een geregelde luchttoevoer worden gebruikt. - Schuif de tang terug uit de schede en in het rectale lumen terwijl u zich in de gesloten positie bevindt (Aanvullende video 1). Plaats de tang tegen de rectale wand direct boven de wond totdat de basis van de kaken is uitgelijnd met de bovenrand van het kijkveld (Figuur 2 & Aanvullende video 1). Blijf de dikke darm volledig insuffleren totdat een duidelijk zicht op de wond kan worden waargenomen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de tang ver genoeg wordt verlengd om alleen de kaken van de tang tot aan de basis te onthullen voor elke muis die wordt onderzocht om een consistente afstand tussen de lens van de endoscoop en de laesie te garanderen(figuur 2,witte pijl). - Als u op dezelfde dag biopsieën uitvoert op meerdere muizen, verwijdert u het biopsied weefsel van de vorige muis uit de tang (met behulp van de meegeleverde reinigingsborstel) en veegt u de lenshuls af met 70% ethanol om deze schoon te maken voordat u een wond in de volgende muis opwekt.
OPMERKING: Hoewel dit protocol het uitvoeren van een enkele biopsie per muis beschrijft, kunnen meerdere biopsieën op één muis worden uitgevoerd, op voorwaarde dat het weefsel uit de vorige biopsie uit de tang wordt verwijderd om ervoor te zorgen dat een volledige biopsie kan worden genomen op volgende biopsieën. - Plaats de muis in een kooileegte van andere muizen en bovenop een handdoek om de luchtwegen vrij te houden totdat deze herstelt van de anesthesie na het voltooien van de procedure. Controleer de muis om ervoor te zorgen dat deze herstelt van de anesthesie zoals aangegeven door activiteit te herwinnen.
OPMERKING: Er zijn twee personen nodig om de wond op te wekken en het wondbed op dag 0 te visualiseren (de endoscoop en de andere met de biopsie forceps), maar er is slechts één persoon nodig voor het visualiseren van wonden op de volgende dagen (zoals hieronder beschreven). - Volg dezelfde procedure voor de voorbereiding van de muis en colonoscopie voor latere wondmetingen (meestal dag 2, 4 en 6 na biopsie), zoals hierboven beschreven in de paragrafen 1.1-1.4, met uitzondering van de inductie van de wond.
- Plaats het wondbed op de videomonitor op deze momenten na het inbrengen van de endoscoop en vervroeg de biopsiedop (in de gesloten positie) naar direct boven het wondbed, instik de dikke darm en start de video-opname, zoals beschreven in de paragrafen 2.1 en 2.2 (figuur 2).
OPMERKING: Het kan moeilijk zijn om het wondbed meer dan 6 dagen na de biopsie te lokaliseren. - Schuif de tang op deze volgende dagen in het lumen naar dezelfde afstand als op dag 0 om een consistente afstand tussen de lens van de endoscoop en de laesie over dagen te garanderen. Het garanderen van een consistente afstand tussen de lens en de laesie zal de nauwkeurigheid van de metingen in de loop van de tijd verbeteren.
OPMERKING: Eén persoon kan op deze dagen metingen uitvoeren (endoscoop wordt met de rechterhand bediend en de biopsiedop wordt met de linkerhand vooruitgeschoven). - Zodra alle metingen zijn voltooid, opent u de video-opnamen van de seriële colonoscopieën in videobewerkingssoftware waarmee foto's van video kunnen worden gemaakt.
- Breng de video naar een frame met een tijdstip waarop het wondbed gemakkelijk kan worden gevisualiseerd, de gesloten tang zich boven het wondbed en tegen de rectale muur bevindt en de muur strak is. Maak een momentopname van dit frame en codeer de bestandsnaam om ervoor te zorgen dat metingen van de wondbedden op een blinde manier worden uitgevoerd.
- Open de afbeeldingen met gecodeerde bestandsnamen in NIH ImageJ om de grootte van het wondbed te kwantificeren. Schakel onder het tabblad Analyseren de optie Metingen instellen in en schakel het selectievakje Gebied in.
- Selecteer het gereedschap Selecties uit de vrije hand in de hoofdmenubalk en teken een omtrek rond de wond (zie figuur 2). Selecteer onder het tabblad Analyseren de optie Meten en de waarde van die meting wordt automatisch ingevuld in het venster Resultaten.
- Exporteer de resultaten naar een spreadsheet nadat u metingen voor alle afbeeldingen hebt voltooid, door Opslaan als te selecteren onder het tabblad Bestand in het venster Resultaten en de extensie te wijzigen in een spreadsheetbestand.
- Bereken de grootte van de wond op dagen na de inductie van de wond (d.w.z. dag 2, 4 en 6) ten opzichte van de grootte op dag 0 (onmiddellijk na het verwonden) in een spreadsheet. Dit bereiken door de grootte van de wond op elke dag te delen door de grootte van de wond op dag 0 en die waarde om te zetten in een percentage.
OPMERKING: Onder normale omstandigheden met behulp van deze methode van colonoscopische weergave, wordt de grootste sluiting van de wond waargenomen na de eerste 2 dagen (~ 75% afname in grootte) met meer geleidelijke sluiting op dag 4 en 6 (respectievelijk ~ 80% en ~ 95% vermindering van de grootte).
3. Verzameling van het wondbed voor moleculaire analyse
- Euthanaseer de muis met behulp van CO 2-verstikking gevolgd door cervicale dislocatie (of gelijkwaardige techniek) op de geselecteerde dag na de biopsie.
- Oogst het distale gebied van de dikke darm door de huid en buikspier te openen om de lichaamsholte bloot te leggen. Plaats een gesloten schaar onder de dikke darm en til voorzichtig op om deze los te maken van de onderliggende mesenterie en snijd vervolgens de dikke darm in het midden en bij de anus om deze van de muis te verwijderen.
- Spoel fecale inhoud met behulp van een rattengavagenaald die is bevestigd aan een spuit van 20 ml gevuld met ijskoude 1x PBS en leg vervolgens de dikke darm op filterpapier.
- Snijd de dikke darm in de lengterichting open op filterpapier en zorg ervoor dat de mesenterische kant naar beneden tegen het filterpapier staat. Breng 0,2% methyleenblauw aan op het slijmvlies met behulp van een knijppijp terwijl het weefsel nog op het filterpapier zit en laat vervolgens overtollig methyleenblauw uitlekken. Bekijk de dikke darm onder een ontleedmicroscoop en lokaliseer het wondbed (figuur 3A).
- Snijd met een micro irisschaar van 4 inch rond de rand van het wondbed(figuur 3A, gestreepte cirkel) en zorg ervoor dat u niet in de spierlaag snijdt (tenzij de spier gewenst is) en breng het ontleede wondbed over naar een buis met een fijnpuntspincet voor snap-freezing of de gewenste opslagmethode.
OPMERKING: De hoeveelheid weefsel die op deze manier wordt verzameld, is voldoende voor het extraheren van RNA voor RNA-seq of gelijkwaardige analyse.
4. Voorbereiding van weefsel voor histologische analyse
- Euthanaseer de muis en oogst de dikke darm zoals beschreven in stap 3.1-3.2.
- Snijd de dikke darm in de lengterichting open op filterpapier en zorg ervoor dat de mesenterische kant naar beneden tegen het filterpapier staat. Breng voorzichtig 4% paraformaldehyde (of fixatief naar keuze) aan met behulp van een knijppijp en bedek het weefsel met parafilm. Laat 4-6 uur plat in een afgesloten container staan.
- Breng weefsels over naar 70% ethanol voor opslag. Wanneer u klaar bent om de weefsels te verwerken, verwijdert u parafilm en brengt u 0,2% methyleenblauw aan op het slijmvlies met behulp van een knijppijp terwijl het weefsel nog op filterpapier staat. Laat vervolgens overtollig methyleenblauw uitlekken.
- Bekijk de dikke darm onder een ontleedmicroscoop en lokaliseer het wondbed (figuur 3A). Gebruik een scalpel met een #10 mes, snijd direct door het midden van het wondbed en ga door de rest van de dikke darm in een rechte lijn, zodat de dikke darm in tweeën is gesneden, qua lengte (figuur 3A, zwarte lijn).
- Verwerk de dikke darm en vervolgens paraffine-inbedding (een of beide zijden die overblijven na het snijden) zodanig dat de kant die door de scalpel is gesneden (de kant die het midden van het wondbed was vóór bissectie) met het gezicht naar beneden in de paraffine is. Ga verder met het snijden van secties en vlekken voor de gewenste vlek(en) of maker(s).
- Als cryosections nodig zijn voor een bepaalde kleuring, oogst dan de dubbele punt zoals beschreven in stap 3.1 en open in de lengterichting op filterpapier, zodat de mesenterische kant naar beneden tegen het filterpapier staat.
- Snijd het wondbed in de vers geoogste dikke darm zoals beschreven in stap 4.5 en sluit de dikke darm (een of beide zijden die overblijven na het snijden) zodanig in dat de kant die door de scalpel is gesneden, met het gezicht naar beneden wordt gesneden in een basisvorm die half gevuld is met weefselbevriezend medium.
- Bevestig het weefsel op zijn plaats met een fijn pincet en plaats de basisvorm op een metalen plaat bovenop droogijs om het vriesmedium uit te harden. Zodra het onderste deel van het medium is bevroren (en het weefsel op zijn plaats wordt gehouden), laat u het weefsel los en vult u het resterende volume van de basisvorm met het vriesmedium en plaatst u het terug op droogijs.
- Nadat het volledige vriesmedium is ingevroren, breng je het over in een vriezer van -80 °C tot het doorsneden is.
- Voor paraffine of bevroren secties, snijd en beits extra secties door H&E om ervoor te zorgen dat het wondbed op de sectie is gevangen voordat u overgaat tot studiespecifieke kleuring. Figuur 3B toont een voorbeeld van een gedeelte waarin het wondbed duidelijk kan worden waargenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kleine items (lens, schede, biopsie forceps) die nodig zijn om biopsieën uit te voeren, worden weergegeven in figuur 1, samen met indicatoren voor een goede assemblage van deze componenten. Figuur 2 toont representatieve beelden van aanvaardbare weergaven van het wondbed om de grootte van het wondbed en de sluitingssnelheid van de wond nauwkeurig te kwantificeren. Een voorbeeld van een ex vivo weergave van het wondbed is weergegeven in figuur 3A, inclusief indicatoren van de omtrek van het wondbed (die het gebied aangeven om te accijnzen voor moleculaire analyse) en waar het weefsel moet worden gesneden om visualisatie van het wondbed bij het snijden mogelijk te maken. Figuur 3B toont een representatief beeld van een H&E-bevlekt gedeelte waarin het wondbed duidelijk kan worden geobserveerd. Aanvullende video 1 biedt een weergave van de biopsieprocedure vanuit de dikke darm van de muis.
Figuur 1: Items die nodig zijn om biopsieën uit te voeren. (A) Afbeelding van lens (a), schede (b) en biopsie tang (c). (B) Plaatsing van de lens in de huls. (C) Inbrengen van een tang door het werkkanaal van de huls (vaste pijl). De pijl met streepje geeft de juiste plaats aan voor de bevestiging van de luchtpomp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Colonoscopische beelden van wondbed na biopsie. Stilstaande beelden werden gemaakt van video-opnamen van colonoscopieën onmiddellijk na biopsie (dag 0) en 2, 4 en 6 dagen later. Blauwe lijnen geven op elk moment de randen van de wondbedden aan. De pijl geeft de juiste lengte van de uitbouw van de tang in het lumen aan om een goede afstand van de lens tot de rectale wand te garanderen, om consistente metingen van het wondbed in de loop van de tijd te garanderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ex vivo en doorsneden afbeeldingen van wondbed. (A) Een dikke darm werd geoogst van een muis 2 dagen na biopsie, bevlekt met 0,2% methyleenblauw en in beeld gebracht onder een ontledende microscoop. De gestreepte cirkel geeft de randen van het wondbed aan. De zwarte lijn geeft de juiste plaats aan om het wondbed/de dikke darm te doorsnijden voordat het wordt ingebed voor doorsnede. (B) Representatief beeld van een H&E-bevlekt gedeelte van een wondbed. Sterretjes geven wondbed aan en pijlen geven intacte crypten naast het wondbed aan die de grenzen van het gewonde gebied aangeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: Biopsieprocedure en beeldvorming van het wondbed. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het waarborgen van consistente en nauwkeurige biopten en metingen van de wondgrootte zijn van het grootste belang bij het effectief evalueren van de snelheid van wondsluiting in dit model. Daarom moeten verschillende maatregelen worden genomen om erop te vertrouwen dat de procedures correct worden uitgevoerd. Ten eerste mag de diepte van de biopsie niet te ondiep of diep zijn. Als het te ondiep is, zal er niet voldoende venster zijn om wondsluiting te evalueren. Figuur 2 toont een optimale biopsiediepte en -grootte op dag 0. Let op het duidelijke onderscheid tussen het slijmvlies rond het wondbed en het weefsel dat onder het wondbed achterblijft (figuur 2). Als de biopsie te diep is, kan perforatie optreden, wat resulteert in een onwaardige muis. Bij insufflatie na biopsie op dag 0, als de buik van de muis ernstig opgezweept raakt, is perforatie opgetreden en kan de muis niet worden gebruikt voor evaluatie en moet deze worden geëuthanaseerd. Het is nuttig als dezelfde persoon de biopsieën voor een bepaalde studie uitvoert om de consistentie verder te waarborgen. Ten tweede is het van cruciaal belang om de biopsie in het rectum uit te voeren en niet in een meer proximaal gebied. Aangezien het rectum dikker is dan meer proximale gebieden van de dikke darm, is er een duidelijk verminderde kans op perforatie. Aan de buitenkant van de schede moet een markering worden aangebracht op 0,5 cm van het uiteinde en de endoscoop mag alleen tot dat punt worden ingebracht om ervoor te zorgen dat de biopsiekracht niet verder reikt dan het rectum. Ten derde is het essentieel om de juiste hoeveelheid insufflatie te hebben, zowel tijdens de biopsie als voor het visualiseren van het wondbed. Tijdens de biopsie, als de dikke darm te opgezweept is, zal de darmwand te strak zijn en zal er niet voldoende slijmvlies zijn voor biopsie. Daarom wordt voorgesteld dat de persoon die de endoscoop gebruikt, zijn wijsvinger niet tegen het open uiteinde van de gasklep drukt om een minimale luchtstroom in de dikke darm mogelijk te maken. De tegenovergestelde benadering moet echter worden gebruikt bij het visualiseren van wondbedden met het oog op het meten van de wondgrootte. Zodra de wond zich bevindt, sluit u de dikke darm volledig in door de wijsvinger stevig tegen het open uiteinde van de gasklep te drukken en daar te houden totdat een gewenst zicht is verkregen. De darmwand moet hiervoor zo strak mogelijk zijn. Let op, volledige insufflatie van de dikke darm is belangrijk om ook te zorgen voor consistente zijdelingse weergaven van het wondbed. Ten slotte is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat een consistente afstand tussen de lens en de wond wordt gehandhaafd om nauwkeurige metingen over meerdere colonoscopieën in dezelfde muizen mogelijk te maken. Een grotere afstand zal het wondbed kunstmatig groter laten lijken dan het is en een grotere afstand zal het kleiner laten lijken. Daarom is het zeer nuttig om de biopsie forceps te gebruiken als een gids voor het handhaven van afstand.
Naast de belangrijkste overwegingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van dit model, zijn er meer kleine punten om op te letten die ook van invloed kunnen zijn op het vermogen om deze procedure effectief uit te voeren. Er moet bijvoorbeeld voor worden gezorgd dat het colonische lumen duidelijk is bij het uitvoeren van colonoscopieën. Hoewel fecaal materiaal wordt gewist door te spoelen met PBS, kan extra materiaal na het inbrengen van de endoscoop in het rectum afdalen. Bovendien kan bloed bij het visualiseren van het wondbed direct na de biopsie het veld verduisteren. Daarom is het soms nodig om de endoscoop uit het rectum te verwijderen, de dikke darm door te spoelen met PBS om het luminale bloed te verwijderen en de endoscoop opnieuw te plaatsen om het wondbed te visualiseren. In bepaalde gevallen kunnen bloed en andere luminale inhoud aan de lens worden hecht, waardoor het veld wordt verduisterd. In deze gevallen moet de endoscoop van de muis worden verwijderd en moet de lens met de borstel worden gewist voordat de beeldvorming wordt voortgezet.
Vóór de komst van het colonoscopisch geleide pinch biopsiemodel hadden onderzoekers beperkte modelsystemen om colonische wondgenezing te onderzoeken. Een van de benaderingen was het herstel evalueren van blootstelling aan chemische inductoren van darmletsel zoals DSS8. Deze benadering maakt het echter niet mogelijk om de omvang van de veroorzaakte schade nauwkeurig te controleren, noch de locatie van de verwonding in de dikke darm. Bovendien kunnen nauwkeurige metingen van slijmvliesgenezing in realtime een uitdaging zijn met deze chemische modellen. Hoewel nuttig, heeft het biopsiemodel ook beperkingen. Operators zijn bijvoorbeeld beperkt tot het uitvoeren van wondwonden in de distale dikke darm. Deze beperking voorkomt studies van kleine darmzweren, een belangrijk klinisch probleem. Bovendien, hoewel deze techniek sommige aspecten van IBD-pathogenese samen vat, kan het niet worden beschouwd als een echt model van deze ziekte. Van technische overweging kan het een uitdaging zijn om consistente wondmaten bij muizen te induceren, waardevolle wonden te genereren of wondbedden te lokaliseren in de latere stadia van het wondgenezingsproces. Wanneer u rekening houdt met deze punten, is het raadzaam om studies met extra muizen te beginnen om rekening te houden met het verlies van onschatbare monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van Crohn's and Colitis Foundation (D.C.M) en New York Crohn's Foundation (D.C.M. en A.J.D.). De auteurs danken mevrouw Carmen Ferrara voor hulp bij het maken van de videobegeleiding van dit artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
