Summary
Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do procedimento para induzir biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e rastrear o fechamento de feridas em tempo real. Além disso, são fornecidos métodos para a preparação de tecidos para análises histológicas, imunohistoquímicas e moleculares do leito da ferida.
Abstract
Compreender as alterações teciduais e celulares que ocorrem na resposta de lesão aguda, bem como durante o processo de cicatrização da ferida, é de suma importância no estudo de doenças do trato gastrointestinal (GI). O modelo de biópsia de pinças coloniais murinas é uma ferramenta útil para definir esses processos. Além disso, a interação entre o conteúdo luminal intestinal (por exemplo, micróbios) e o cólon pode ser estudada. No entanto, a indução da ferida e a capacidade de rastrear o fechamento da ferida ao longo do tempo de forma confiável podem ser desafiadoras. Além disso, a preparação e orientação tecidual devem ser realizadas de forma padronizada para interrogar de forma ideal alterações histológicas e moleculares. Aqui, apresentamos um método detalhado descrevendo a lesão induzida pela biópsia e o monitoramento do fechamento da ferida através de colonoscopias repetidas. Uma abordagem é descrita que garante medições consistentes e reprodutíveis do tamanho da ferida, a capacidade de coletar o leito da ferida para análises moleculares, bem como visualizar o leito da ferida após a secção dos tecidos. A capacidade de realizar com sucesso essas técnicas permite estudos da resposta de lesão aguda, cicatrização de feridas e interações luminal-hospedeira dentro do cólon.
Introduction
O trato gastrointestinal (GI) é um sistema de órgãos complexo dadas suas múltiplas funções, tipos de células hospedeiras (por exemplo, epiteliais, imunes, estromicas, etc.) bem como trilhões de micróbios. Diante dessa complexidade, as doenças do trato de GI muitas vezes envolvem a interação de todos esses fatores. Por exemplo, as doenças inflamatórias intestinais (DII) estão associadas a ciclos de inflamação e remissão no trato GI, envolvendo a ativação de células inflamatórias, disbiose e reparação epitelial1,2,3,4,5,6,7. Ter sistemas de modelos adequados para estudar o DIB e outras condições inflamatórias do trato GI é fundamental para elucidar a patogênese da doença. Existem vários modelos para estudar a patogênese do IBD, incluindo camundongos geneticamente modificados e o uso de produtos químicos como o sulfato de sódio dextran (DSS) em roedores8,9,10. As limitações desses modelos incluem a incapacidade de controlar precisamente a indução da inflamação, bem como dificuldades na avaliação da cicatrização da ferida. Métodos alternativos para imitar aspectos da patogênese do IBD podem ser úteis para o desenvolvimento de terapias.
Biópsias de pinças orientadas colonoscópicas em camundongos oferecem um sistema modelo útil para estudar a patogênese da resposta inflamatória, a cicatrização de feridas, bem como interações hospedeira-micróbios no cólon. Esta abordagem foi usada pela primeira vez como ferramenta experimental em 2009, que demonstrou sua utilidade para estudar a resposta inflamatória aguda e a cicatrização de feridas no intestino11. Estudos subsequentes utilizaram essa técnica para avaliar os papéis de diferentes vias de sinalização, bem como a microbiota intestinal, na cicatrização de feridas coloniais11,12,13,14,15,16,17,18. Mais recentemente, nosso grupo usou esse modelo para investigar a importância da sinalização de sphingosine-1-fosfato e bactérias na resposta aguda à lesão cólon19. Embora útil, realizar biópsias de pinças guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliar alterações de tecido subsequentes pode ser tecnicamente desafiador. Por exemplo, a perfuração do intestino pode ocorrer após a indução de lesão e garantir medidas consistentes do leito da ferida através de colonoscopias seriais pode ser difícil. Além disso, orientar adequadamente o tecido colonial para visualizar o leito da ferida para análises histológicas ou imunohistoquímicas pode ser um desafio. Embora existam algumas informações sobre esses métodos18,20, uma descrição precisa dessas técnicas junto promete melhorar a confiabilidade e a utilidade mais ampla deste modelo. Aqui, apresentamos um método detalhado para realizar biópsias de pinças colonoscópicas guiadas em camundongos, rastrear o fechamento de feridas ao longo do tempo e preparar o tecido para permitir análises histológicas e moleculares do leito da ferida. A criação de um método padrão para a realização dessas técnicas pode expandir o uso deste modelo para estudar mediadores não investigados anteriormente que são potencialmente importantes para inflamação gi e reparação de feridas.
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Protocol
Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Weill Cornell Medicine." Para: "Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Weill Cornell Medicine e da Universidade Stony Brook.
1. Colonoscopia e indução de feridas
- Pré-monte os componentes do endoscópio inserindo primeiro o endoscópio de furo rígido de 1,9 mm na baia(Figura 1A-B). Conecte a bomba de ar (para fornecer insuficiência cólon) utilizando a tubulação fornecida, à válvula de gás no lado esquerdo da baia ao lado do canal de trabalho(Figura 1C).
NOTA: Embora a lente descrita aqui seja 0°, uma lente de 30° também pode ser usada para este fim. - Certifique-se de que o canal de trabalho está na posição aberta e insira 3 fórceps de biópsia fr através do canal de trabalho e avance-o até o final da bainha (garantindo que ele não se saliente para fora da bainha) (Figura 1C). Conecte o endoscópio montado à fonte de luz e ao dispositivo de imagem de vídeo por instruções do fabricante.
- Anestesiar o rato com 5% de isoflurane com oxigênio em uma câmara de indução. Em seguida, mova o mouse para uma plataforma de estadiamento endoscópica contendo um sistema de aquecimento (para evitar hipotermia) em seu lado ventral e mantenha sob anestesia usando um cone de nariz com 2% de isoflurano com oxigênio. Adicione pomada veterinária aos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia. Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado, apertando suavemente o pé traseiro para testar um reflexo.
NOTA: Qualquer cepa ou qualquer sexo de camundongos pode ser usado com esta técnica; no entanto, é preferível que os camundongos tenham pelo menos 8 semanas de idade para que sejam grandes o suficiente para o procedimento.- Adicione pomada veterinária aos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
- Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado, apertando suavemente o pé traseiro para testar um reflexo.
- Encha uma seringa de 3 mL com uma agulha de gavage de rato anexada com soro fisiológico tamponado por fosfato de temperatura ambiente (PBS). Insira agulha de aproximadamente 1 cm no ânus do rato e infunda suavemente o PBS para limpar o material fecal. Várias pelotas fecais devem sair do rato junto com o PBS que foi infundido.
NOTA: A instilação de um volume excessivo de PBS pode resultar na formação de espuma no lúmen que poderia obscurecer a visualização do lúmen. - Insira o endoscópio montado 0,5 cm no ânus do mouse. Avançar os fórceps de biópsia para o lúmen do reto até que as 'mandíbulas' completas (incluindo a dobradiça) dos fórceps estejam além do fim da bainha (como observado no monitor de vídeo) (Vídeo Suplementar 1). Gire os fórceps 90° para que as mandíbulas abram em uma orientação leste-oeste(Vídeo Suplementar 1).
- Para biópsia, abra os fórceps e avance aproximadamente 1 cm, feche os fórceps e em um movimento suave puxe rapidamente para trás nos fórceps, deixando-os fechados(Vídeo Suplementar 1).
- Evite insususpecionar totalmente o cólon durante a realização da biópsia. Portanto, deixe o lado direito da válvula de gás aberto durante esta etapa; embora deva ser observado que ao abrir os fórceps há o risco de danificar a mucosa quando o cólon está nesta posição.
2. Visualizando e medindo o leito da ferida
- Inicie a gravação de vídeo imediatamente após a biópsia pressionando o pedal do pé ligado ao dispositivo de gravação de colonoscópe. Insuflê totalmente o cólon pressionando firmemente um dedo indicador contra o lado direito da válvula de gás para cobrir completamente a abertura, a fim de forçar o ar para dentro do endoscópio e, assim, para o cólon.
NOTA: Embora este protocolo descreva o uso de uma bomba de ar na qual o fluxo de ar é controlado manualmente, uma bomba peristáltica com uma fonte de ar controlada também pode ser usada. - Avance os fórceps para fora da bainha, e para o lúmen retal enquanto estiver na posição fechada(Vídeo Suplementar 1). Coloque os fórceps contra a parede retal imediatamente acima da ferida até que a base das mandíbulas esteja alinhada com a borda superior do campo de visão (Figura 2 & Vídeo Suplementar 1). Continue insusentando o cólon até que uma visão clara da ferida possa ser observada.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para estender os fórceps o suficiente para revelar apenas as mandíbulas dos fórceps até a base para cada rato que está sendo examinado, a fim de garantir uma distância consistente entre a lente do endoscópio e a lesão(Figura 2,seta branca). - Se realizar biópsias em vários camundongos no mesmo dia, remova o tecido biópsia do rato anterior dos fórceps (usando a escova de limpeza fornecida) e limpe a bainha da lente com 70% de etanol para limpá-lo antes de induzir uma ferida no próximo rato.
NOTA: Embora este protocolo descreva a realização de uma única biópsia por rato, várias biópsias podem ser realizadas em um único rato, desde que o tecido retirado da biópsia anterior seja removido dos fórceps, a fim de garantir que uma biópsia completa possa ser feita em biópsias subsequentes. - Coloque o rato em uma gaiola vazia de outros ratos e em cima de uma toalha para manter as vias aéreas limpas até que ele se recupere da anestesia após completar o procedimento. Monitore o mouse para garantir que ele se recupere da anestesia, conforme indicado pela recuperação da atividade.
NOTA: Duas pessoas são obrigadas a induzir a ferida e visualizar o leito da ferida no dia 0 (uma operando o endoscópio e a outra operando os fórceps biópsias), mas apenas um indivíduo é necessário para visualizar feridas nos dias subsequentes (como descrito abaixo). - Siga o mesmo procedimento de preparação do camundongo e colonoscopia para medidas subsequentes da ferida (tipicamente dias 2, 4 e 6 após biópsia), conforme descrito acima nas seções 1.1-1.4, exceto pela indução da ferida.
- Localize o leito de ferida no monitor de vídeo nestes pontos de tempo após a inserção do endoscópio, e avance os fórceps (na posição fechada) para imediatamente acima do leito da ferida, insuflou o cólon e inicie a gravação de vídeo, conforme descrito nas seções 2.1 e 2.2(Figura 2).
NOTA: Pode ser difícil localizar o leito da ferida mais de 6 dias após a biópsia. - Avance os fórceps para o lúmen nestes dias subsequentes para a mesma distância do dia 0 para garantir uma distância consistente entre a lente do endoscópio e a lesão ao longo dos dias. Garantir uma distância consistente entre a lente e a lesão aumentará a precisão das medidas ao longo do tempo.
NOTA: Um indivíduo pode realizar medições nestes dias (o endoscópio é operado com a mão direita e os fórceps da biópsia são avançados com a mão esquerda). - Uma vez concluídas todas as medições, abra as gravações de vídeo das colonoscopias seriais em software de edição de vídeo que permite a criação de fotos paradas a partir de vídeo.
- Avance o vídeo para um quadro mostrando um ponto no tempo em que o leito da ferida pode ser facilmente visualizado, os fórceps fechados estão acima do leito da ferida e contra a parede retal e a parede está esticada. Tire um instantâneo deste quadro e codificou o nome do arquivo para garantir que as medidas das camas de ferida sejam realizadas de forma cega.
- Abra as imagens com nomes de arquivos codificados no NIH ImageJ para quantificar o tamanho da cama ferida. Na guia Analisar, selecione Definir medidas e verifique a caixa Área.
- Selecione a ferramenta seleções Freehand na barra principal do menu e desenhe um perímetro ao redor da ferida (ver Figura 2). Na guia Analisar a medida e o valor dessa medição será preenchido automaticamente na janela Resultados.
- Exporte os resultados para uma planilha após concluir as medições para todas as imagens, selecionando Salvar Como na guia Arquivo dentro da janela Resultados e alterando a extensão para se tornar um arquivo de planilha.
- Calcule o tamanho da ferida nos dias seguintes à indução da ferida (ou seja, dias 2, 4 e 6) em relação ao tamanho do dia 0 (imediatamente após o ferimento) em uma planilha. Este é o seguinte dividindo o tamanho da ferida em cada dia pelo tamanho da ferida no dia 0 e convertendo esse valor em uma porcentagem.
NOTA: Em condições normais utilizando este método de visualização colonoscópica, o maior fechamento da ferida é observado após os primeiros 2 dias (~75% de redução de tamanho) com fechamento mais gradual nos dias 4 e 6 (~80% e ~95% de redução no tamanho, respectivamente).
3. Coleta do leito de ferida para análise molecular
- Eutanize o camundongo usando asfixia de CO2 seguida de luxação cervical (ou técnica equivalente) no dia selecionado após a biópsia.
- Colher a região distal do cólon abrindo a pele e o músculo abdominal para expor a cavidade corporal. Coloque a tesoura fechada sob o cólon e levante-a suavemente para soltá-la da mesenteria subjacente e, em seguida, corte o cólon no seu ponto médio e no ânus para removê-lo do rato.
- Lave o teor fecal usando uma agulha de gavage de rato presa a uma seringa de 20 mL cheia de PBS 1x gelado e, em seguida, deite o cólon sobre o papel filtro.
- Abra o cólon longitudinalmente no papel do filtro, garantindo que o lado mesentérico esteja de frente para baixo contra o papel filtro. Aplique 0,2% de azul de metileno na mucosa usando um tubo de aperto enquanto o tecido ainda está no papel do filtro e, em seguida, drene o excesso de azul de metileno. Veja o cólon sob um microscópio dissecando e localize o leito da ferida(Figura 3A).
- Usando uma tesoura micro-íris de 4 polegadas, corte ao redor da borda do leito de ferida(Figura 3A, círculo tracejado) tomando cuidado para não cortar na camada muscular (a menos que o músculo seja desejado) e transfira a cama de ferida dissecada para um tubo usando pinças de ponta fina para congelar ou método de armazenamento desejado.
NOTA: A quantidade de tecido coletada dessa forma é suficiente para extrair RNA para RNA-seq ou análise equivalente.
4. Preparação de tecido para análise histológica
- Eutanize o rato e colher o cólon como descrito na etapa 3.1-3.2.
- Abra o cólon longitudinalmente no papel do filtro, garantindo que o lado mesentérico esteja de frente para baixo contra o papel filtro. Aplique suavemente 4% de paraformaldeído (ou fixador de escolha) usando um tubo de aperto e cubra o tecido com parafilme. Deixe o apartamento em um recipiente selado por 4-6 horas.
- Transfira tecidos para 70% de etanol para armazenamento. Quando estiver pronto para processar os tecidos, remova o parafilme e aplique 0,2% de azul metileno na mucosa usando uma pipeta de aperto enquanto o tecido ainda está no papel filtro. Em seguida, escorra o excesso de azul de metileno.
- Veja o cólon sob um microscópio dissecando e localize o leito da ferida(Figura 3A). Usando um bisturi com uma #10 lâmina, corte diretamente pelo centro da cama da ferida e continue cortando o restante do cólon em linha reta, de tal forma que o cólon tenha sido cortado ao meio, em termos de comprimento(Figura 3A, linha preta).
- Processe o cólon e, em seguida, incorporar parafina (um ou ambos os lados que permanecem após o corte) de tal forma que o lado que foi cortado pelo bisturi (o lado que era o centro da cama ferida antes da biseção) está de bruça para baixo na parafina. Proceda a seções de corte e coloração para manchas desejadas ou fabricantes.s.
- Se forem necessárias crioseções para uma determinada coloração, colde o cólon conforme descrito na etapa 3.1 e abra longitudinalmente sobre o papel filtro, garantindo que o lado mesentérico esteja de bruça contra o papel filtro.
- Bissecte o leito de ferida dentro do cólon recém-colhido como descrito na etapa 4.5 e incorpore o cólon (um ou ambos os lados que permanecem após o corte) de modo que o lado que foi cortado pelo bisturi esteja de bruços em um molde de base meio cheio de meio de congelamento tecidual.
- Fixar o tecido no lugar com pinças finas e colocar o molde base em uma placa de metal em cima de gelo seco para endurecer o meio de congelamento. Uma vez que a porção inferior do meio esteja congelada (e o tecido seja mantido no lugar), solte o tecido e encha o volume restante do molde base com meio de congelamento e coloque de volta no gelo seco.
- Depois que todo o volume do meio de congelamento estiver congelado, transfira para um congelador de -80 °C até a secção.
- Para parafina ou seções congeladas, corte e manche seções adicionais por H&E para garantir que o leito da ferida tenha sido capturado na seção antes de prosseguir para a coloração específica do estudo. A Figura 3B mostra um exemplo de uma seção na qual o leito da ferida pode ser claramente observado.
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Representative Results
Os pequenos itens (lente, bainha, biópsia) necessários para a realização de biópsias são mostrados na Figura 1, juntamente com indicadores de montagem adequada desses componentes. A Figura 2 mostra imagens representativas de visões aceitáveis do leito da ferida, a fim de quantificar com precisão o tamanho do leito da ferida e a taxa de fechamento da ferida. Um exemplo de visão ex vivo do leito da ferida é mostrado na Figura 3A, inclusive, de indicadores do perímetro do leito da ferida (indicando a região para consumo para análise molecular) e onde cortar o tecido para permitir a visualização do leito da ferida após a secção. A Figura 3B mostra uma imagem representativa de uma seção manchada de H&E na qual o leito da ferida pode ser claramente observado. O Vídeo Suplementar 1 fornece uma visão do procedimento de biópsia de dentro do cólon do rato.
Figura 1: Itens necessários para a realização de biópsias. (A) Imagem das lentes (a), bainha (b) e biópsia (c). (B) Inserção da lente na baia. (C) Inserção de fórceps através do canal de trabalho da bainha (seta sólida). A seta tracejada indica o local correto para a fixação da bomba de ar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens colonoscópicas do leito da ferida após a biópsia. Imagens paradas foram criadas a partir de gravações de vídeo de colonoscopias imediatamente após a biópsia (Dia 0) e 2, 4 e 6 dias depois. Linhas azuis indicam as bordas das camas de ferida em cada ponto de tempo. A seta indica o comprimento correto da extensão dos fórceps no lúmen para garantir a distância adequada da lente até a parede retal, a fim de garantir medidas consistentes do leito de ferida ao longo do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens ex vivo e seccionadas da cama da ferida. (A) Um cólon foi colhido de um rato 2 dias após a biópsia, manchado com 0,2% de azul metileno e imageado sob um microscópio dissecador. O círculo tracejado indica as bordas do leito da ferida. A linha preta indica o local adequado para bissecção do leito/cólon antes de incorporar para secção. (B) Imagem representativa de uma seção manchada de H&E de uma cama ferida. Asteriscos indicam que o leito de ferimentos e flechas indicam criptas intactas adjacentes ao leito de ferida indicando as fronteiras da região ferida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1: Procedimento de biópsia e imagem da cama da ferida. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Garantir biópsias consistentes e precisas, bem como medidas de tamanho da ferida são de suma importância ao tentar avaliar efetivamente a taxa de fechamento da ferida neste modelo. Portanto, várias medidas devem ser tomadas para ter certeza de que os procedimentos estão sendo realizados corretamente. Primeiro, a profundidade da biópsia não deve ser muito rasa ou profunda. Se for muito raso, não haverá uma janela suficiente para avaliar o fechamento da ferida. A Figura 2 demonstra uma ótima profundidade e tamanho da biópsia no dia 0. Note a clara distinção entre a mucosa ao redor do leito da ferida e o tecido que permanece sob o leito da ferida(Figura 2). Se a biópsia for muito profunda, a perfuração pode ocorrer, resultando em um rato inestimáveis. Após a insuficiência após a biópsia no dia 0, se o abdômen do camundongo ficar severamente distendido, ocorreu perfuração e o rato não pode ser usado para avaliação e deve ser eutanizado. É útil se o mesmo indivíduo realizar as biópsias para um determinado estudo para garantir ainda mais consistência. Em segundo lugar, é fundamental realizar a biópsia no reto e não em uma região mais proximal. Dado que o reto é mais espesso do que regiões mais proximais do cólon, há uma chance significativamente reduzida de perfuração. Uma marca deve ser feita na parte externa da bainha 0,5 cm da extremidade e o endoscópio só deve ser inserido até esse ponto para garantir que os fórceps da biópsia não se estendam além do reto. Em terceiro lugar, ter a quantidade certa de insuficiência durante a biópsia e para visualizar o leito da ferida é essencial. Durante a biópsia, se o cólon estiver muito distendido, a parede colonial estará muito esticada e não haverá uma quantidade suficiente de mucosa para a biópsia. Portanto, sugere-se que o indivíduo que opera o endoscópio não pressione o dedo indicador contra a extremidade aberta da válvula de gás, a fim de permitir o mínimo de fluxo de ar para o cólon. No entanto, a abordagem oposta deve ser usada ao visualizar leitos de feridas com a finalidade de medir o tamanho da ferida. Uma vez localizada a ferida, insufrua totalmente o cólon pressionando o dedo indicador firmemente contra a extremidade aberta da válvula de gás e segure-o lá até que uma visão desejada seja obtida. A parede colonial deve ser o mais tensa possível para este fim. Note-se que a insuflação total do cólon é importante para garantir também vistas laterais consistentes do leito da ferida. Por fim, é fundamental garantir que uma distância consistente seja mantida entre a lente e a ferida para permitir medições precisas sobre múltiplas colonoscopias nos mesmos camundongos. Uma distância mais próxima fará artificialmente o leito da ferida parecer maior do que é e uma distância mais distante fará com que pareça menor. Portanto, usar os fórceps de biópsia como guia para manter a distância é muito útil.
Além das principais considerações a serem tomadas em conta ao utilizar esse modelo, há mais pontos menores a serem conscientizados que também podem impactar a capacidade de realizar esse procedimento de forma eficaz. Por exemplo, deve-se ter certeza de que o lúmen colonial é claro ao realizar colonoscopias. Embora o material fecal seja limpo por lavagem com PBS, material adicional pode descer para o reto depois de inserir o endoscópio. Além disso, ao visualizar o leito da ferida imediatamente após a biópsia, o sangue pode obscurecer o campo. Portanto, às vezes é necessário remover o endoscópio do reto, lavar o cólon com PBS para limpar o sangue luminal e reinserir o endoscópio para visualizar o leito da ferida. Em certos casos, sangue e outros conteúdos luminosos podem ser aderidos às lentes, obscurecendo o campo. Nestes casos, o endoscópio deve ser removido do mouse e a lente deve ser limpa usando a escova antes de continuar a imagem.
Antes do advento do modelo de biópsia de pinça guiado colonoscópico, os pesquisadores tinham sistemas de modelos limitados para investigar a cicatrização de feridas coloniais. Uma abordagem foi avaliar a recuperação da exposição a indutores químicos de lesões coloniais como o DSS8. No entanto, esta abordagem não permite um controle preciso da extensão da lesão que está sendo induzida nem a localização da lesão em todo o cólon. Além disso, medições precisas da cicatrização mucosa em tempo real podem ser desafiadoras com esses modelos químicos. Embora útil, o modelo de biópsia também tem limitações. Por exemplo, os operadores estão limitados a realizar ferimentos no cólon distal. Essa limitação previne estudos de úlcera intestinal pequena, uma questão clínica importante. Além disso, embora essa técnica recapitula alguns aspectos da patogênese do DIB, ela não pode ser considerada um verdadeiro modelo desta doença. De consideração técnica, pode ser desafiador induzir tamanhos consistentes de feridas em camundongos, gerar feridas valiosas ou localizar leitos de feridas nos estágios posteriores do processo de cicatrização da ferida. Ao levar esses pontos em consideração, é aconselhável iniciar estudos com camundongos adicionais para explicar a perda de amostras inestimáveis.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Crohn's and Colitis Foundation (D.C.M) e da Fundação Crohn de Nova York (D.C.M. e A.J.D.). Os autores agradecem à sra. Carmen Ferrara pela ajuda na criação do acompanhamento do vídeo deste artigo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
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