Summary
Detta protokoll beskriver bedömningen av subcellulära fack-specifika redox status inom cellen. En redox-känslig fluorescerande sond möjliggör bekväm ratiometrisk analys i intakta celler.
Abstract
Mätning av den intracellulära oxidations-/reduktionsbalansen ger en översikt över en organisms fysiologiska och/eller patofysiologiska redoxstatus. Thioler är särskilt viktiga för att belysa redox status av celler via deras minskade dithiol och oxiderad disulfid nyckeltal. Konstruerade cysteinhaltiga fluorescerande proteiner öppnar en ny era för redoxkänsliga biosensorer. En av dem, redox-känsliga gröna fluorescerande protein (roGFP), kan enkelt införas i celler med adenoviral transduktion, vilket gör att redox status subcellulära fack som skall utvärderas utan att störa cellulära processer. Minskad cysteiner och oxiderade cystiner av roGFP har excitation maxima på 488 nm och 405 nm, respektive, med utsläpp på 525 nm. Att bedöma förhållandet mellan dessa reducerade och oxiderade former gör det möjligt att bekvämt beräkna redoxbalansen i cellen. I denna metod artikel, förevigade mänskliga trippel-negativa bröstcancerceller (MDA-MB-231) användes för att bedöma redox status inom den levande cellen. Protokollet steg inkluderar MDA-MB-231 cellinje transduktion med adenovirus att uttrycka cytosolic roGFP, behandling med H2O2,och bedömning av cystein och cystin förhållandet med både flöde cytometri och fluorescensmikroskopi.
Introduction
Oxidativ stress definierades 1985 av Helmut Sies som "en störning i prooxidant-antioxidant balans till förmån för den förra"1, och en uppsjö av forskning har utförts för att få sjukdom-, näring-, och åldrande-specifika redox status av organismer1,2,3. Sedan dess har förståelsen av oxidativ stress blivit bredare. Testa hypoteser att använda antioxidanter mot sjukdomar och / eller åldrande har visat att oxidativ stress inte bara orsakar skada utan också har andra roller i celler. Dessutom har forskare visat att fria radikaler spelar en viktig roll för signaltransduktion2. Alla dessa studier stärker vikten av att bestämma förändringarna i minskning-oxidation (redox) förhållandet mellan makromolekyler. Enzymaktivitet, antioxidanter och/eller oxidanter, och oxidationsprodukter kan bedömas med olika metoder. Bland dessa, metoder som bestämmer tiool oxidation är utan tvekan den mest använda eftersom de rapporterar om balansen mellan antioxidanter och prooxidanter i celler, liksom organismer4. I synnerhet används förhållandet mellan glutation (GSH)/glutationdisulfid (GSSG) och/eller cystein (CyS)/cystin (CySS) som biomarkörer för övervakning av organismernas redoxstatus2.
Metoder som används för att analysera balansen mellan prooxidanter och antioxidanter bygger främst på nivåerna av reducerade/oxiderade proteiner eller små molekyler i celler. Västerländska blots och masspektrometri används för att i stort sett bedöma förhållandet mellan reducerade/oxiderade makromolekyler (protein, lipider etc.), och GSH/GSSG-förhållanden kan bedömas med spektrofotometri5. Ett vanligt inslag i dessa metoder är den fysiska störningen av systemet genom celllys och/eller vävnadshomogenisering. Dessa analyser blir också utmanande när det är nödvändigt att mäta oxidationsstatus för olika cellulära fack. Alla dessa störningar orsakar artefakter i analysen miljön.
Redox-känsliga fluorescerande proteiner öppnade en fördelaktig era för att utvärdera redoxbalansen utan att orsaka störningar i cellerna6. De kan rikta olika intracellulära fack, vilket gör det möjligt att kvantifiera fackspecifika aktiviteter (t.ex. analysera redox tillståndet för mitokondrierna och cytosol) för att undersöka överhörning mellan cellulära organeller. Gult fluorescerande protein (YFP), grönt fluorescerande protein (GFP) och HyPeR-proteiner granskas av Meyer och kollegor6. Bland dessa proteiner är redox-känsliga GFP (roGFP) unik på grund av olika fluorescerande avläsningar av cys (ex. 488 nm/em. 525 nm) och CySS (ex. 405 nm/525 nm) rester, vilket möjliggör ratiometrisk analys, till skillnad från andra redox-känsliga proteiner som YFP7,8. Ratiometric output är värdefull eftersom det uppväger skillnaderna mellan uttrycksnivåer, detektionskänsligheter och fotobleaching8. Subcellulära delar av celler (cytosol, mitokondrierna, kärnan) eller olika organismer (bakterier och däggdjursceller) kan riktas genom att ändra roGFP7,,9,10.
roGFP-analyser utförs med fluorescerande bildtekniker, särskilt för visualiseringsexperiment i realtid. Flödescytometriska analyser av roGFPs är också möjliga för experiment med förutbestämda tidpunkter. Den aktuella artikeln beskriver både användningen av fluorescerande mikroskopi och flöde cytometri att utföra en ratiometric bedömning av redox status i däggdjursceller överuttrycka roGFP (riktade till cytosol) via adenoviral transduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det här protokollet har optimerats för 70–80 % samtidiga MDA-MB-231-celler. För andra cellinjer bör antalet celler och infektionsmultipendier (MOI) återuppbyggas.
1. Beredning av celler (dag 1)
- Underhåll MDA-MB-231 cellinje i 75 cm2 flaskor med 10 ml Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) vid 37 °C i en 5% CO2 fuktad atmosfär.
OBS: DMEM kompletteras med 10% FBS, 37 °C, och en 5% CO2 fuktad atmosfär används för alla fastsättning och behandling inkubationer i hela protokollet. - Förbered MDA-MB-231-cellerna för experiment.
- Sug upp mediet i kolven, lossa cellerna med 2 ml 0,25% trypsin-EDTA-lösning i 2 min och inaktivera trypsinaktiviteten med 6 ml komplett medium (DMEM med 10% FBS). Centrifugera cellerna i 150 x g i 5 min. Sug supernatanten och suspendera cellerna i 5 ml komplett medium.
- Blanda en lika stor volym cell suspension och 0,4% trypan blå. Ta 10 μL av denna blandning och räkna cellerna med den automatiserade cellräknaren.
OBS: En Coulter-räknare eller en hemocytometer kan också användas för cellräkning. - Sådd cellerna i en 6-brunnsplatta för flödescytometrianalyser och utsäde av 150 000 celler i 1 ml medium per brunn. Vänta 16 h på cellbilank.
- Sådd cellerna i en 4 brunnskammare bild för fluorescerande avbildning och utsäde 25.000 celler i 0,5 ml medium per brunn. Vänta 16 h på cellbilank.
OBS: Frökontrollbrunnar utöver behandlingsbrunnar. Använd en av kontrollbrunnarna för att bestämma cellnummer (valfritt: om fästperioden för cellerna är kortare än fördubblingstiden kan cellnummer antas vara samma som sådensiteten) och den andra för en icke-infekterad kontroll (0 MOI).
2. Adenoviral roGFP transduktion (dag 2 och 3)
VARNING: Adenovirus kan orsaka sjukdomar. När du konstruerar cellerna, använd filtrerade tips och dekontaminera tips, Pasteur pipetter och mikrocentrifugrör med 10% blekmedel.
OBS: Detta protokoll har visats med cytosol-specifika roGFP, men andra cellulära fack (t.ex. mitokondrierna eller mitokondriellt intermembrane utrymme) kan riktas med samma protokoll.
- Generera en dosresponskurva för moi för att erhålla den högsta transduktionseffektiviteten genom att beräkna volymen av adenovirus (ml) som krävs för varje MOI-värde för MDA-MB-231 cellinje (tabell 1):
OBS: Funktionell titer för varje parti adenovirallager, som uttrycks som plackformningsenhet (PFU) per ml, tillhandahålls av företaget. Den optimala MOI för transduktion skiljer sig mellan celltyper. För de flesta däggdjursceller är det optimala MOI-området mellan 10 och 300. Enligt cellsvaret ska MOI-värdena räknas om (t.ex. bör MOI-området minskas om cellerna har cytotoxiskt svar eller om området ska ökas om cellerna har låg transduktionseffektivitet). - Gör 1:100 utspädning av 6 x 1010 PFU/mL adenoviral roGFP-lösning med cellodlingsmedium (DMEM med 10% FBS) för tillförlitlig pipettering.
- Pipett och tillsätt 0,0125 ml (12,5 μL), 0,025 ml (25 μL), 0,05 ml (50 μL) adenoviral roGFP-utspädning i varje brunn av 6-brunnsplattan för att transducera de 150 000 cellerna med 50, 100 respektive 200 MOI för flödescytometrianalys(tabell 1).
- Pipett och tillsätt 0,0042 ml (4,2 μL) adenoviral roGFP-utspädning i 4-kammarens glidbrunnar för att transducera 25 000 celler med 100 MOI för fluorescensavbildning (tabell 1).
OBS: En minimal mängd medium bör användas i brunnarna för att säkerställa den högsta interaktionen mellan adenoviral roGFP konstruktion och celler. Serumhalten i odlingsmediet kan behöva minskas för olika cellinjer eftersom höga serumnivåer kan påverka transduktionseffektiviteten negativt i vissa celltyper. - Inkubera celler i 16–24 timmar under cellunderhållsförhållandena. Nästa dag (dag 3), ändra medium till cell odling medium (DMEM med 10% FBS) för att möjliggöra cellåtervinning för ytterligare 24 h. Visualisera celler under ett mikroskop för att bedöma deras morfologi; celler kan uttrycka roGFP även om de har morfologiska förändringar.
OBS: Dag 3, celler bör börja uttrycka roGFP; Därför kan transduktionseffektiviteten övervakas med fluorescensmikroskopi (filter med ex. 488/em. 525). För att uppnå konsekventa analysresultat, vara medveten om och dokumentera de morfologiska förändringarna under faskontrastmikroskopet och observera morfologi samtidigt som transduktionseffektivitet utvärderas. - Konstruera en dosresponskurva med hjälp av 50-, 100- och 200 MOI-proverna som tagits fram i steg 2.3 och deras resultat för transduktionseffektivitet som erhållits från flödescytometrianalys (steg 3.1 och 4.1). Utvärdera optimal transduktionseffektivitet med dokumentation av morfologiska förändringar (steg 2.5) och dos-responskurvan för MOI.
OBS: Även om mer än 98% av cellpopulationen på 100 MOI och 200 MOI express roGFP (se representativa resultat), visade 200 MOI-gruppen betydande förändringar i cellmorfologi av MDA-MB-231 celler. Följaktligen var den mest effektiva MOI för MDA-MB-231 celler bestäms vara 100 MOI. - Efter optimal MOI (här, 100 MOI) valdes för MDA-MB-231 cellinje, utföra experiment med testmaterial (10 μM H2O2 och dess fordon 0,1% avjoniserat vatten).
- Förbered och så ut cellerna enligt avsnitt 1. Med hjälp av den adenovirala transduktionsvolymen för 100 MOI beräknad i steg 2.1 upprepar du steg 2,2−2,4 för 100 MOI adenoviraltransduktion av celler. Inkubera sedan plattan och kammarglasen enligt steg 2.5.
3. Förvärv av CyS/CySS-balans
- Flödescytometri (dag 4)
- På dag 4 inkubera celler från steg 2.7.1 med 10 μM H2O2 för 1 h.
OBS: 10 μM H2O2 användes som testämne och 0,1 % avjoniserat vatten användes som fordonsbehandling i detta protokoll. Andra oxiderande medel kan användas som positiva kontroller här. - Sug upp media från 6-brunnsplattan, byt ut 750 μL av 0,25% trypsin-EDTA-lösning och vänta i 2 min på att cellerna lossnar. Inaktivera trypsin med 2 ml komplett medium (DMEM med 10% FBS) och samla in volymen i 15 ml koniska rör.
- Centrifugera rören vid 150 x g i 5 min vid 4ºC. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 500 μL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Upprepa steg 3.1.3
- Filtrera cellupphängningarna till flödescytometrikompatibla rör med 40 μm maska. Håll rören på is och borta från ljuset och följ steg 4.1 för dataanalys.
- På dag 4 inkubera celler från steg 2.7.1 med 10 μM H2O2 för 1 h.
- Mikroskopisk avbildning (dag 4)
- Behandla cellerna med 10 μM H 2 O 2 dag 4, behandla celler med 10 μM H2O2, omedelbart ta bilder (tidspunkt 0) och 1 h efter behandling och följ steg 4.2 för dataanalys.
4. Dataanalys
- Flöde cytometri kvantifiering
- Ange flödescytometrimetod för 3 olika analyser via programvara för provinsamling (se Tabell över material): framåtsppunkt (FCS) på x-axel- och sidosppunkt (SSC) på y-axeln för att bedöma cellernas storlek och komplexitet (SSC kan användas för grov identifiering av döda och levande celler). ex. 488 nm/em. 525 nm (fluorescein isothiocyanaate [FITC]) bandpassfilter på x-axeln och SSC på y-axeln för att bedöma CyS-roGFP; ex. 405 nm/em. 525 nm (Brilliant Violet 510 [BV510]) bandpassfilter på x-axeln och SSC på y-axeln för att bedöma CySS-roGFP.
- Skaffa 0 MOI-kontroll och visualisera celler med exempelinsamlingsprogramvara. Upprepa detta steg för återstående prover (50, 100, 200 MOI-grupper och senare 10 μM H2O2 behandlade celler och fordonsbehandlade celler). Spara filerna för dataanalys.
- Programvara för öppen dataanalys (se Tabell över material)och öppna 0 MOI-exempelfil. Bedöm cellpopulationen av intresse (gate 1). Ställ in följande gatings för att minimera bakgrundsfluorescens för ex. 488 nm/em. 525 nm (Gate 2) och ex. 405 nm/em. 525 nm (Gate 3) bandpassfilter med de icke-infekterade (0 MOI) kontrollcellerna.
- Öppna 50, 100 och 200 MOI-exempelfiler i dataanalysprogramvara för att bedöma dosresponskurvan. Analysera medelfluoresintensiteter med gates 2 och 3 för varje prov. Upprepa detta steg för provexemplar (10 μM H2O2 behandlade celler och fordonsbehandlade celler).
- Beräkna förhållandet mellan medelstressad fluorescerande intensitet mellan oxiderade kontra reducerade former av roGFP med följande ekvation.
- Bildbedömning
- Använd ett mikroskop som innehåller fluorescensfilter för CyS-roGFP och CySS-roGFP (ex. 488 nm/em. 525 nm respektive ex. 405 nm/em. 525 nm filter).
- I varje brunn i kammaren bilden, plocka 4 slumpmässiga områden för att förvärva bilder, med hjälp av 4x målet att visualisera större områden.
20x-mål kan också användas för bilddisplayer. - Öppna bilden med ImageJ programvara11. Använd Analysera | Mät kommandon för varje bild och använd ekvationen i steg 4.1.5 för att kvantifiera data.
OBS: Kvantifiering av bilderna är ratiometric; Därför innehåller protokollet inte subtraktion av bakgrunden. Men för att kunna jämföra bilder måste ljusstyrka, kontrast och mättnad vara desamma för varje bild. Statistisk signifikans bedömdes med enkelriktad analys av varians (ANOVA) och Tukeys post hoc-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Redox-tillståndet för CyS/CySS är lätt att analysera med transducerade roGFPs. Den fluorescerande sonden kvantifierar förhållandet mellan de reducerade och oxiderade formerna (excitationsvåglängder 488 nm respektive 405 nm). Fluorescensdata kan erhållas genom både flödescytometri och mikroskopi.
Ett stort antal celler kan konsekvent och bekvämt förvärvas med hjälp av flödescytometri. Analysen består av tre huvudsteg: 1) välj cellpopulation av intresse med FSC-områdesfiltret (figur 1A). 2) gate roGFP-uttrycker celler med ex. 488/em. 525 nm med ett selektivt bandpassfilter (figur 1B), och 3) utfärda de oxiderade roGFP-innehållande cellerna från de roGFP-uttryckande cellerna med ex. 405 nm/em. 525 nm bandpassfilter (bild 1C).
Varje ny cellinje bör utvärderas för den optimala adenovirala transduktionseffektiviteten hos roGFPs. Transduktionseffektiviteten bör bedömas med morfologiska utvärdering av celler och roGFP-uttrycksanalyser med flödescytometri och/eller fluorescerande mikroskopi. Detta protokoll använder flödescytometri för att bestämma dosresponskurvan för roGFP-analyser och för att välja den mest effektiva MOI-ingången (figur 2A−H). Enligt MOI dos-respons kurvan (figur 2I), 200 MOI gav högsta roGFP uttryck, men cell morfologi påverkades, vilket tyder på cytotoxicitet. Därför bestämdes den optimala transduktionseffektiviteten vara med 100 MOI.
För att utvärdera metodens effektivitet användes H2O2 som en positiv kontroll för oxidation. Hundra MOI användes för optimal transduktion. Efter återhämtningsperioden behandlades cellerna med 10 μM H2O2 för 1 h för att erhålla fluorescensförhållandet via flödescytometri. Oxiderad (ex. 405 nm/em. 525nm) och minskad (ex. 488 nm/em. 525 nm) roGFP genomsnittliga fluorescensintensiteter erhölls från flödescytometrianalyser för fordon (figur 3A, B) och 10 μM H2O2 (figur 3C, D)behandlingar. De överlagrad histogrammen representerar förskjutningen av cellnumren 10 μM H2O2 och fordonsbehandlade grupper för reducerade (figur 3E) och oxiderade (figur 3F) roGFP. Förhållandet mellan oxiderat och reducerat roGFP visar att 10 μM H2O2 orsakade en 3-faldig ökning av oxidation av roGFP jämfört med fordonsbehandling (figur 3G).
Fluorescerande avbildning av celler utfördes också med 10 μM H2O2 under mikroskopet i 1 h. Bilder togs under 4x-målet, och representativa bilder togs under 20x-målet (figur 4A). Fluorescerande intensitet utvärderades med ImageJ programvara och nyckeltal beräknades. En stadig tillståndsökning i H2O2-inducerad oxidation upptäcktes (figur 4B). inkubation med H2O2 för 1 h ökade oxidationen av roGFP cysteiner, som uppvisade betydande förändring mellan fordonskontroller.
Figur 1: Gating-inställning för fluorescerande intensiteter av cys-innehållande (reducerade) roGFP- och CySS-innehållande (oxiderade) roGFP-rester med icke-transducerade MDA-MB-231-celler. (A) Cellpopulationen av intresse valdes som gate 1 med SSC- och FSC-områdesfilter. (B)roGFP-uttrycksceller valdes enligt celler som inte uttrycker som gate 2 med ex. 488/em. 525 nm bandpassfilter. (C)Oxiderade (cystin) roGFP-innehållande celler var gated med ex. 405 nm/em. 525 nm bandpassfilter från roGFP-uttryckspopulationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: BEDÖMNING av MOI-dos-responskurva med flödescytometrianalyser för MDA-MB-231-cellinje. (A,B) Icke-infekterade celler och (C,D) 50 MOI, (E,F) 100 MOI, och(G,H)200 MOI roGFP-uttryck cell populationer som förvärvats för gating setup, respektive. (I)Transduced celler utvärderades och ritades i procent enligt cellpopulationen av intresse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Flödescytometribedömning av CyS/CySS-balans i roGFP-transduced MDA-MB-231 cellinje. Fordonsbehandlade celler utvärderades som(A)% roGFP-uttrycksceller, och (B) % oxiderade roGFP-uttrycksceller och H2O2 behandling bedömdes med samma parametrar i paneler (C) och (D). Cell räkna histogram av fordonet och H2O2 behandling överlagrades för (E) minskade roGFP ex. 488/em. 525 bandpassfilter och (F) oxiderat roGFP ex. 405/em. 525 bandpassfilter. G)Medelvärdet för fluorescensintensitetsförhållanden mellan oxiderade/reducerade former ritades in i ett stapeldiagram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Fluorescerande avbildning av roGFP-transduced MDA-MB-231. a) Representativa bilder efter 1 h behandling med fordon eller H2O2. (B)Förhållandet mellan oxiderade/reducerade former utvärderades i 4 slumpmässigt valda områden, och staplar representerar medelvärdet ± standardavvikelse. Statistisk signifikans mellan grupper som anges som *(p < 0,05), **(p < 0,01) eller ***(p < 0,005). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Typ av analys | Cellnummer per brunn | Adenoviral roGFP PFU/mL | 1:100 utspädning av adenoviral roGFP PFU/mL | Moi | Transduktionsvolym (ml) |
| Flöde cytometri | 150,000 | 6 x 1010 | 6 x 108 | 0 | 0 |
| 50 | 0.0125 | ||||
| 100 | 0.025 | ||||
| 200 | 0.05 | ||||
| Fluorescensmikroskopi | 25,000 | 6 x 1010 | 6 x 108 | 100 | 0.0042 |
Tabell 1: Beräkning av MOI-värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tiol/disulfid balans i en organism återspeglar redox status av celler. Levande organismer har glutation, cystein, protein tioler, och lågmolekylära tioler, som alla påverkas av nivån av oxidation och upprepa redox status cellerna4. Konstruerade roGFPs tillåter icke-störande kvantifiering av tiol/ disulfidbalansen via deras CyS rester7. Den ratiometriska egenskapen hos roGFP ger tillförlitliga redoxmätningar för däggdjursceller. roGFP kan enkelt föras in i celler med transfection metoder och/ eller transduktion vektorer, men adenoviral transduktion har högre effektivitet.
Cellernas redoxstatus påverkas lätt av cellmiljön (t.ex. cellernas sammanflödet och medievolymen). För detta protokoll fastställdes den optimerade cellsåddheten till 60–70 %, med 15 000 celler per cm2. på analysdagen var cellerna 70–80 % konfluenta. Cellmorfologi och fördubblingstid skiljer sig dock mellan cellinjerna. Om forskaren avser att använda en annan cellinje bör cellkonfluensitet därför justeras vid förvärv av mätningar med flödescytometri och/eller fluorescensmikroskopi. Detta kommer att säkerställa korrekta resultat baserat på deras experimentella design och behov.
roGFPs kan enkelt introduceras till celler med flera transfection metoder och / eller transduktion vektorer. Det nuvarande protokollet använder cytosol-specifika roGFP konstruktion, som omvandlas till celler med ett adenovirus. Innan du påbörjar ett experiment är det viktigt att bestämma MOI-dos-responsen för en cellinje; Detta gör det möjligt att fastställa maximal transduktionseffektivitet med minimal celltoxicitet för att utforma det optimala, reproducerbara protokollet.
CyS/CySS-statusen för roGFP-transducerade celler kan bedömas med både fluorescerande avbildning och flödescytometri. Båda analyserna har sina för- och nackdelar; flödescytometri gör det möjligt att snabbt utvärdera en större cellpopulation, men fluorescensavbildning har högre känslighet för roGFP-specifika celler. Dessutom bekräftar det också korrekt subcellulär lokalisering av GFP (t.ex. cytosolic kontra mitokondriellt). Här användes både flödescytometri och fluorescerande avbildning av forskarna. Även om H2O2 anses vara en svag oxidant för roGFP konstruera7,visade protokollet att båda metoderna är känsliga nog att upptäcka ratiometric förändringar mellan oxiderade och minskade former av roGFP efter H2O2 behandling.
Detta roGFP-protokoll kan användas för att bestämma redox-status för olika däggdjurscelltyper. För att förstå menadion-inducerad kardiomyocytdöd i samband med prooxidant / antioxidant balans, Loor och kollegor används både cytosoliska och mitokondriellroGFP märkning i kardiomyocyter12. roGFP möjliggör visualisering av redox status av celler medan de lever, och den fackspecifika inriktning möjliggör en bättre förståelse av sjukdomar. Esposito och kollegor ses över användningen av roGFP för att bestämma redox status av celler i neurodegenerativa sjukdomar13. Eftersom roGFP transduktion i olika organismer, inklusive växter14 och bakterier9, är lätt att utföra, övervakning redox status för både bakterie-och värdceller under sjukdomstillstånd kan underlätta innovativ behandling metoder. Dessutom kan in vivo-studier som utförts med fackspecifik roGFP på transgena djur belysa organismernas redoxstatus15,,16.
I vissa situationer är dock roGFP biosensor otillräcklig för att undersöka fysiologiskt relevanta redox förändringar5 och H2O2 oxidation7 inom celler. Peroxidas selektivitet för H2O2 användes för att konstruera känsligare sonder6. Jästperoxidas ORP1 var kopplad till roGFP för att möjliggöra den känsliga mätningen av H2O2-medierad tiooloxidation17,18,19. På samma sätt övervakar införlivandet av humant glutaredoxin (Grx1) i roGFP-sensorn specifikt GSH/GSSG-jämvikten i cellfacken6,,18,19.
Detta lätt tillämpliga protokoll gör det möjligt för forskare att övervaka fackspecifika redox status i intakta celler, minimera artifactual oxidation på grund av fysisk stress under cellhomogenisering. Det nuvarande protokollet visar 2 kvantifieringsmetoder: flödescytometri (fördelaktigt för snabba analyser av stora cellpopulationer) och fluorescerande mikroskopi (möjliggör kontinuerlig time-lapse-avbildning och bestämning av cellernas morfologi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Konstruktionen och rekombinanta adenovirus för att uttrycka cytosol-specifika roGFP i celler genererades i laboratoriet av Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University, och ViraQuest Inc., respektive. Denna studie stöddes av Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy grant P20GM109005 genom NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation / Medicinsk forskning Endowment Award AWD00053956, UAMS årsskiftet kansler's Awards AWD00053484. Flödescytometrikärnan stöds delvis av Center for Microbial Pathogenesis och Host Inflammatory Responses grant P20GM103625 genom COBRE NIGMS. Innehållet är enbart upphovsmännens ansvar och representerar inte nödvändigtvis NIH:s officiella åsikter. ATA fick stöd av The Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2214-A stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P.
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
