İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti
Summary
mikroRNA’lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.
Abstract
İmmünoglobulin A (IgA) nefropatisi, IgA’nın anormal birikimi ile karakterize bir primer glomerülonefrit türüdür ve son dönem böbrek yetmezliğine yol açar. Son yıllarda IgA nefropatisinin patogenezinde mikroRNA’ların (miRNA’lar) tutulumu bildirilmiştir. Bununla birlikte, küçük hayvan modelleri kullanılarak IgA nefropatisinde miRNA’ların profilini çıkarmak için belirlenmiş bir yöntem yoktur. Bu nedenle, bir IgA fare modelinin (HIGA fare) böbreğindeki miRNA’yı analiz etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu protokolün amacı, HIGA farelerinin böbreklerindeki miRNA’ların değişmiş ekspresyon seviyelerini, kontrol farelerinin böbreklerindeki seviyelerle karşılaştırıldığında tespit etmektir. Kısacası, bu yöntem dört adımdan oluşur: 1) HIGA farelerinden böbrek örnekleri almak; 2) böbrek örneklerinden toplam RNA’nın saflaştırılması; 3) toplam RNA’dan tamamlayıcı DNA’nın sentezlenmesi; ve 4) miRNA’ların kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR). Bu yöntemi kullanarak, HIGA farelerinin böbreklerindeki birkaç miRNA’nın (miR-155-5p, miR-146a-5p ve miR-21-5p) ekspresyon seviyelerini başarıyla tespit ettik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA’ların profilini çıkaran diğer çalışmalara uygulanabilir.
Introduction
İmmünoglobulin A (IgA) nefropatisi, renal glomerüler mezangial bölgede anormal IgA birikimi ile karakterize bir primer glomerülonefrit türüdür 1,2. Primer glomerülonefritin en sık görülenidir ve hastaların% 20-40’ında son dönem böbrek yetmezliğine yol açar2. Nedeni hala bilinmemekle birlikte kalıcı mukozal enfeksiyon 1,3 ile ilişkilendirilmiştir. Kortikosteroidler, immünsüpresanlar ve renin-anjiyotensin sistemi inhibitörleri terapötik yöntemler olarak önerilmiştir1,3, ancak tam olarak belirlenememiştir3. Bu nedenle, IgA nefropatisinin etiyolojisini ve tedavi yöntemlerini açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
mikroRNA’lar (miRNA’lar), gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan küçük, kodlamayan RNA’lardır 4,5. miRNA’ların çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynadığı bildirilmiştir ve bazıları hastalık biyobelirteçleri ve terapötik ajanlar olarak tanımlanmıştır 4,5. Son yıllarda miRNA’lar ile IgA nefropatisinin patogenezi arasında bir ilişki olduğu da bildirilmiştir 2,6,7. Örneğin, miR-148b’nin IgA nefropatisi 2,6,7 olan hastalarda IgA’nın yapısal anormalliklerine dahil olduğu gösterilirken, miR-148b ve let-7b, IgA nefropatisi 7’yi saptamak için yeni biyobelirteçler olarak belgelenmiştir. MiRNA’ların IgA nefropatisi üzerindeki etkilerini anlamak, etiyolojiyi ve tedaviyi daha fazla aydınlatmaya yardımcı olabilir2, küçük hayvan modelleri kullanılarak IgA nefropatisinde miRNA’ların profilini çıkarmak için standart yöntemler henüz oluşturulmamıştır2.
Burada, bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki miRNA ekspresyon seviyelerini ölçmek için basit ve güvenilir bir yöntem geliştirdik. HIGA faresi, özellikle yüksek serum IgA seviyesini ve böbrek glomerüllerinde anormal IgA birikimini gösteren karakteristik bir ddY suşudur 8,9,10,11. Bu nedenle, HIGA fareleri bir IgA nefropati fare modeli 8,9,10,11 olarak kullanılabilir. Yöntemimiz dört ana adımdan oluşmaktadır: Birincisi, HIGA farelerinden cerrahi olarak böbrek örnekleri elde etmek; ikincisi, numunelerin homojenleştirilmesi ve silika membran bazlı bir spin sütunu kullanılarak toplam RNA’nın saflaştırılması; üçüncüsü, ters transkripsiyon kullanarak toplam RNA’dan tamamlayıcı DNA’nın (cDNA) sentezlenmesi; ve dördüncüsü, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile miRNA’nın ekspresyon seviyelerinin saptanması. Bu yöntemin gerekçesi ve sonuçların güvenilirliği önceki raporlara dayanmaktadır12,13. Bunun bir IgA nefropatisi fare modelinde miRNA ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için yararlı bir teknik olduğunu ve IgA nefropatisindeki miRNA’lara yönelik gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yeni yöntemi kullanarak bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki miRNA’ların ekspresyon seviyelerini ölçebildik. IgA nefropatisi, etiyolojisini ve terapötik hedeflerini açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyan açıklanamayan bir hastalıktır 1,3. Bununla birlikte, insan böbrek örneklerinin elde edilmesi oldukça invazivdir. Bu yeni teknik, küçük hayvanlar kullanılarak IgA nefropatisinin incel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makalenin taslağını düzenlediği için Edanz Group’tan (www.edanzediting.com) Dr. Sarah Williams’a teşekkür ederiz.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
