Summary
وتشارك microRNAs في التسبب في اعتلال الكلية IgA. لقد طورنا طريقة موثوقة للكشف عن مستويات تعبير microRNA في كليتي نموذج فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA). ستسهل هذه الطريقة الجديدة التحقق من تورط miRNAs في اعتلال الكلية IgA.
Abstract
اعتلال الكلية بالغلوبولين المناعي A (IgA) هو نوع من التهاب كبيبات الكلى الأولي الذي يتميز بالترسب غير الطبيعي ل IgA ، مما يؤدي إلى الفشل الكلوي في المرحلة النهائية. في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن تورط microRNAs (miRNAs) في التسبب في اعتلال الكلية IgA. ومع ذلك ، لا توجد طريقة ثابتة لتحديد سمات miRNAs في اعتلال الكلية IgA باستخدام نماذج حيوانية صغيرة. لذلك ، قمنا بتطوير طريقة موثوقة لتحليل miRNA في كلية نموذج الماوس IgA (ماوس HIGA). الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن مستويات التعبير المتغيرة لل miRNAs في كليتي الفئران HIGA عند مقارنتها بالمستويات الموجودة في الكلى للفئران الضابطة. باختصار ، تتكون هذه الطريقة من أربع خطوات: 1) الحصول على عينات الكلى من الفئران HIGA. 2) تنقية الحمض النووي الريبي الكلي من عينات الكلى. 3) توليف الحمض النووي التكميلي من إجمالي الحمض النووي الريبي ؛ و 4) تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) ل miRNAs. باستخدام هذه الطريقة ، اكتشفنا بنجاح مستويات التعبير للعديد من miRNAs (miR-155-5p و miR-146a-5p و miR-21-5p) في كليتي فئران HIGA. يمكن تطبيق هذه الطريقة الجديدة على دراسات أخرى تنميط miRNAs في اعتلال الكلية IgA.
Introduction
اعتلال الكلية المناعي A (IgA) هو نوع من التهاب كبيبات الكلى الأولي الذي يتميز بالترسب غير الطبيعي ل IgA في المنطقة المتوسطة الكبيبية الكلوية 1,2. هذا هو الأكثر شيوعا من التهاب كبيبات الكلى الأولي ويؤدي إلى الفشل الكلوي في المرحلة النهائية في 20 ٪ -40 ٪ من المرضى2. لا يزال السبب غير معروف ولكن العدوى المخاطية المستمرة متورطة 1,3. تم اقتراح الستيرويدات القشرية ومثبطات المناعة ومثبطات نظام الرينين أنجيوتنسين كطرق علاجية1،3 ، ولكن لم يتم تأسيسها بالكامل 3. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتوضيح المسببات والطرق العلاجية لعلاج اعتلال الكلية IgA.
microRNAs (miRNAs) هي RNAs صغيرة غير مشفرة تلعب دورا مهما في تنظيم التعبير الجيني 4,5. تم الإبلاغ عن أن miRNAs متورطة في التسبب في أمراض مختلفة ، وقد تم تحديد بعضها كمؤشرات حيوية للمرض وعوامل علاجية 4,5. في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ أيضا عن ارتباط بين miRNAs والتسبب في اعتلال الكلية IgA2،6،7. على سبيل المثال ، تبين أن miR-148b متورط في التشوهات الهيكلية ل IgA في المرضى الذين يعانون من اعتلال الكلية IgA2،6،7 ، بينما تم توثيق miR-148b و let-7b كمؤشرات حيوية جديدة للكشف عن اعتلال الكلية IgA 7. على الرغم من أن فهم آثار miRNAs على اعتلال الكلية IgA قد يساعد في توضيح المسببات والعلاج 2 ، إلا أن الطرق القياسية لتحديد سمات miRNAs في اعتلال الكلية IgA باستخدام نماذج حيوانية صغيرة لم يتم تحديدها بعد2.
لقد طورنا هنا طريقة بسيطة وموثوقة لقياس مستويات تعبير miRNA في كليتي نموذج فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA). فأر HIGA هو سلالة DDY مميزة تظهر مستوى مرتفعا بشكل خاص من مصل IgA وترسب غير طبيعي ل IgA في كبيبات الكلى8،9،10،11. لذلك ، يمكن استخدام الفئران HIGA كنموذج فأر اعتلال الكلية IgA8،9،10،11. تتكون طريقتنا من أربع خطوات رئيسية: أولا ، الحصول جراحيا على عينات الكلى من فئران HIGA. ثانيا ، تجانس العينات وتنقية الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا ؛ ثالثا ، توليف الحمض النووي المكمل (cDNA) من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي ؛ ورابعا ، الكشف عن مستويات التعبير عن miRNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR). ويستند الأساس المنطقي لهذه الطريقة وموثوقية النتائج إلى التقارير السابقة12,13. لقد أظهرنا أن هذه تقنية مفيدة لقياس مستويات تعبير miRNA بدقة في نموذج فأر اعتلال الكلية IgA ، وأنه يمكن استخدامه لتسهيل البحث المستقبلي في miRNAs في اعتلال الكلية IgA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة جيتشي الطبية والامتثال لإرشادات استخدام ورعاية التجارب من دليل جامعة جيتشي الطبية لحيوانات المختبر.
1. الحصول على عينات الكلى من الفئران HIGA
ملاحظة: تظهر الفئران HIGA نمطا ظاهريا مستقرا لاعتلال الكلية IgA بعد 25 أسبوعا من عمر8،9،10،11. يجب اختيار الفئران Balb / c كمجموعة تحكم8،9،10،11. تم الحصول على إناث فئران HIGA البالغة من العمر 25 أسبوعا (ن = 10) وإناث فئران Balb / c البالغة من العمر 25 أسبوعا (ن = 10). من الضروري تحديد عدد الفئران المطلوبة للتجارب مقدما. تتطلب هذه الخطوة حوالي 7-8 ساعات لحجم عينة من 10 فئران HIGA و 10 فئران Balb / c.
- تحضير هذه العناصر: فئران HIGA (25 أسبوعا ، أنثى) ، فئران Balb / c (25 أسبوعا ، أنثى) ، جهاز تخدير الاستنشاق ، إيزوفلوران ، لوح الفلين ، دبوس ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، محاقن الحقن ، الإبر ، المقص الجراحي ، والملقط.
- تخدير ماوس HIGA باستخدام 4٪ -5٪ من الأيزوفلوران مع جهاز التخدير بالاستنشاق وتثبيته في الوضع الظهري على ورقة الفلين باستخدام المسامير. ضبط تركيز الأيزوفلوران إلى 2 ٪ -3 ٪ كجرعة الصيانة بعد تحريض التخدير.
ملاحظة: يتم الحفاظ على عمق التخدير عند مستوى يتم فيه التخلص تماما من الألم المرتبط بالإجراء الجراحي. على وجه الخصوص ، يجب تعديل تركيز الأيزوفلوران إلى 4-5 ٪ عند استئصال الأنسجة مثل الصدر. إزالة الشعر ومرهم العين ليست ضرورية. ليس من الضروري تركيب الماوس على وسادة التدفئة إذا كان من الممكن تنفيذ الإجراء بسرعة. - قم بعمل شق خط الوسط 3-4 سم لجدار بطن الفأر بالمقص الجراحي والملقط وحدد بعناية جانبي الكلى.
- شق الضلوع والحجاب الحاجز بالمقص الجراحي والملقط لكشف القلب. بعد شق الأذين الأيمن ، قم بحقن PBS في البطين الأيسر حتى يتغير لون الكلى إلى اللون الأصفر الباهت (هذا الإجراء يعني أن جسم الفأر بالكامل يتخلل ب PBS.)
- قطع الشريان الكلوي والوريد الكلوي والحالب وإزالة الكلى. قسم الكلى إلى قطع 30 ملغ لاستخدامها في الخطوة التالية.
ملاحظة: يشمل علم أمراض اعتلال الكلية IgA بشكل رئيسي الكبيبة في القشرة الكلوية (الجزء الخارجي من الكلى). على الرغم من صعوبة التمييز المجهري والكامل بين القشرة والنخاع ، إلا أنه من المستحسن جمع الجزء الخارجي من الكلى بشكل أساسي. يمكن تخزين هذه العينات في -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
2. تنقية الحمض النووي الريبي الكلي من عينات الكلى
ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم استخدام مجموعة عزل miRNA المتاحة تجاريا لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام عمود الدوران تمزيق البوليمر الحيوي. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل إضافية. تحتوي مجموعة عزل miRNA على عمود دوران قائم على غشاء السيليكا ، وكواشف تحلل أساسها الفينول / جوانيدين ، ومخزن مؤقت لغسل الغوانيدين / الإيثانول (عازل غسيل 1) ، ومخزن مؤقت لغسل الإيثانول (عازل غسيل 2) ، وماء خال من النيوكلياز. تتطلب هذه الخطوة حوالي 3 ساعات لحجم عينة من 10 فئران HIGA و 10 فئران تحكم.
- قم بإعداد العناصر التالية: أنابيب تجميع 1.5 أو 2.0 مل ، إيثانول 100٪ ، كلوروفورم ، خالط السيليكون ، ماصات دقيقة ، أطراف ماصة ، أجهزة طرد مركزي ، عمود دوران تمزيق البوليمر الحيوي ، عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا ، كواشف التحلل القائمة على الفينول / الغوانيدين ، عازلة غسيل الغوانيدين / الإيثانول (عازلة الغسيل 1) ، عازلة غسيل الإيثانول (عازلة الغسيل 2) ، والمياه الخالية من النيوكلياز.
- تجانس عينات الكلى 30 ملغ باستخدام خالط السيليكون و 700 ميكرولتر من كاشف التحلل القائم على الفينول / جوانيدين في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: تكون miRNAs في العينة عرضة للخطر حتى تتعرض لكاشف تحلل الفينول / الجوانيدين ، لذا يجب تنفيذ هذه الخطوات على الفور. - انقل المحللة إلى عمود الدوران لتمزيق البوليمر الحيوي وطردها مركزيا عند 15000 × جم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أضف 140 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الراشح واخلطه بقوة لمدة 15 ثانية. اتركيه لمدة 2-3 دقائق ، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
- انقل المادة الطافية الشفافة برفق دون لمس الطبقة الوسطى إلى أنبوب تجميع جديد وأضف الحجم المحدد (انظر أدناه) من الإيثانول بنسبة 100٪. دوامة لمدة 5 ثوان.
ملاحظة: مطلوب 100٪ إيثانول عند 1.5x حجم المادة الطافية التي تم الحصول عليها. - نقل العينة (الحد الأعلى 700 ميكرولتر) إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا والطرد المركزي للعينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ثانية عند 8000 × جم. تخلص من المرشح بعد الطرد المركزي.
- أضف 700 ميكرولتر من محلول الغسيل 1 إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا وطرد مركزي العمود في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ثانية عند 8000 × جم. تخلص من المرشح بعد الطرد المركزي.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2 إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا وطرده مركزيا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ثانية عند 8000 × جم. تخلص من المرشح بعد الطرد المركزي.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2 إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا وطرده مركزيا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ثانية عند 8000 × جم. تخلص من المرشح بعد الطرد المركزي.
- أجهزة الطرد المركزي عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا مرة أخرى دون إضافة أي شيء لإزالة أي إيثانول إضافي ، عند 15000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المرشح بعد الطرد المركزي.
- قم بتغيير الأنبوب المتصل بعمود الدوران إلى أنبوب تجميع جديد.
- أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا وطرده مركزيا عند 8000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يحتوي المحلول الناتج 30 ميكرولتر على تركيز عال من إجمالي الحمض النووي الريبي. يمكن تخزين هذه العينة في درجة حرارة -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
3. تخليق cDNA من إجمالي الحمض النووي الريبي
ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم استخدام مجموعة النسخ العكسي المتوفرة تجاريا. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل إضافية. تحتوي هذه المجموعة على مزيج الحمض النووي ومزيج النسخ العكسي والمخزن المؤقت. يجب تنفيذ هذا الإجراء على الجليد لمنع تقدم التفاعل. تتطلب هذه الخطوة حوالي 3 ساعات لحجم عينة من 10 فئران HIGA و 10 فئران تحكم.
- قم بإعداد العناصر التالية: أنابيب تجميع 1.5 مل ، وأنابيب شريطية ذات ثمانية آبار ، وماصات دقيقة ، وأطراف ماصة ، ومقياس الطيف الضوئي ، وماء خال من النيوكلياز ، وثلج ، ومزيج حمض نووي ، ومزيج إنزيم النسخ العكسي ، ومخزن مؤقت ، ودورة حرارية.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، احسب الحجم المطلوب من الماء الخالي من النيوكلياز بحيث يحتوي 12 ميكرولتر على 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي.
- قم بإعداد مزيج رئيسي بالمحتويات التالية: 2.0 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي ، و 2.0 ميكرولتر من مزيج النسخ العكسي ، و 4.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت إلى إجمالي 8.0 ميكرولتر لكل عينة.
- أضف 8 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من أنابيب الشريط المكونة من ثمانية آبار.
- تمييع إجمالي الحمض النووي الريبي في حجم الماء الخالي من النيوكلياز المحسوب في 3.2. ثم أضف 12 ميكرولتر من إجمالي محلول الحمض النووي الريبي (يحتوي على 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي) إلى كل بئر من أنابيب شريطية من ثمانية آبار.
- احتضان العينة في 8 أنابيب شريطية للبئر عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة باستخدام جهاز التدوير الحراري. ثم احتضان في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق باستخدام دورة حرارية.
ملاحظة: يحتوي المحلول بعد الحضانة على تركيز عال من الحمض النووي الكيميائي. - انقل هذا المحلول إلى أنبوب سعة 1.5 مل وأضف 200 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
ملاحظة: يمكن استخدام المحلول الناتج البالغ 200 ميكرولتر ل qRT-PCR كقالب cDNA. يمكن تخزين هذه العينة في -80 °C لمدة 1 سنة تقريبا.
4. qRT-PCR من miRNA
ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم استخدام مجموعة PCR المتاحة تجاريا. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل إضافية. تحتوي هذه المجموعة على مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل وبرايمر عالمي وماء خال من النيوكلياز. يجب إعداد العينات من نسختين ، ويجب مراعاة دقة النتائج في كل حالة. يتم قياس مستويات التعبير عن miRNA بواسطة طريقة ΔΔCT. تتطلب هذه الخطوة حوالي 4 ساعات لحجم عينة من 10 فئران HIGA و 10 فئران تحكم.
- قم بإعداد العناصر التالية: أنبوب تجميع 1.5 مل ، لوحة تفاعل 96 بئرا ، فيلم لاصق للوحة تفاعل 96 بئرا ، ماصات دقيقة ، أطراف ماصة ، مزيج PCR ، برايمر عالمي ، ماء خال من النيوكلياز ، بادئات خاصة ب miRNA ، وأداة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.
- قم بإعداد المزيج الرئيسي بالمحتويات التالية: 12.5 ميكرولتر من مزيج PCR ، 2.5 ميكرولتر من التمهيدي العالمي ، 1.25 ميكرولتر من 5 ميكرومتر التمهيدي الخاص ب miRNA ، و 6.25 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز لكل بئر.
ملاحظة: في هذا الفحص ، تم استخدام البادئات الخاصة ب miRNAs [RNA و U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2) و miR-155-5p و miR-146a-5p و miR-21-5p]. تم استخدام RNU6-2 كعنصر تحكم داخلي14. - أضف 22.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من لوحة تفاعل البئر 96.
- أضف 2.5 ميكرولتر من cDNA المحضر في الخطوة 3.7 إلى البئر الفردي للوحة البئر 96.
- قم بتغطية لوحة تفاعل البئر 96 بغشاء الالتصاق ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 30 ثانية.
- قم بتشغيل أداة PCR في الوقت الفعلي. قم ببرمجة أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: التنشيط الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم 40 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
- تحديد التعبير الجيني باستخدام طريقة ΔΔCT. يتم تحديد مستويات التعبير النسبي على أنها 2-ΔΔCT.
ملاحظة: يجب مراعاة منحنيات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل غير الطبيعية لاستبعادها من النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بالتحقيق في مستويات التعبير عن miRNAs في كليتي الفئران HIGA (ن = 10). تم الحصول على هذه النتيجة بالكامل بناء على البروتوكول الموصوف. تم اختيار كليتي فئران Balb / c كعنصر تحكم (n = 10). في كلتا المجموعتين ، تم اختيار الذين تتراوح أعمارهم بين 25 أسبوعا. كانت إناث الفئران HIGA فقط متاحة من المورد. مستويات التعبير لثلاثة miRNAs (miR-155-5p و miR-146a-5p و miR-21-5p ؛ الشكل 1) تم الكشف عنها ، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا على أنها مرتبطة باعتلال الكلية IgA15,16. تمت مقارنة مستويات تعبير miRNA النسبية للمجموعتين باستخدام اختبار t ، مع P < 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم التعبير عن miR-155-5p عند مستويات أعلى بمقدار 3.3 أضعاف في مجموعة HIGA مقارنة بالمجموعة الضابطة (P < 0.001) ، بينما تم التعبير عن miR-21-5p عند مستويات أعلى بمقدار 1.58 مرة في مجموعة HIGA (P = 0.007). لم يختلف تعبير miR-146a-5p بشكل كبير بين المجموعتين.
الشكل 1: مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبوزي الرسول (miRNAs) في كليتي فأرجن الهيجا. حدد qRT-PCR مستويات التعبير النسبية ل miR-155-5p و miR-146a-5p و miR-21-5p في الفئران HIGA (n = 10) والفئران Balb / c (n = 10). يتم عرض مستويات التعبير النسبية كقيم متوسطة وأخطاء قياسية. (أ) كان تعبير miR-155-5p أعلى بمقدار 3.3 أضعاف في مجموعة HIGA (P < 0.001). (ب) لم يختلف تعبير miR-146a-5p اختلافا كبيرا بين المجموعتين. (C) كان تعبير miR-21-5p أعلى بمقدار 1.58 مرة في مجموعة HIGA (P = 0.007). تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) ؛ الحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) ؛ ليست مهمة (NS) ؛ *، ص <0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمكنا من قياس مستويات التعبير عن miRNAs في كليتي فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA) باستخدام هذه الطريقة الجديدة. اعتلال الكلية IgA هو مرض غير مبرر يحتاج إلى مزيد من البحث لتوضيح مسبباته وأهدافه العلاجية 1,3. ومع ذلك ، فإن الحصول على عينات الكلى البشرية أمر شديد التوغل. هذه التقنية الجديدة مفيدة من حيث أنها تسمح بدراسة اعتلال الكلية IgA باستخدام الحيوانات الصغيرة ويجب أن تسهل البحث المستقبلي في اعتلال الكلية IgA و miRNAs. في دراسة مستقبلية ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسة miRNAs الجديدة لعلاج اعتلال الكلية IgA. قد يؤثر التعديل الاصطناعي ل miRNAs في الفئران HIGA على النمط الظاهري لاعتلال الكلية IgA. في هذه الحالة ، قد تكون هذه الطريقة مفيدة للتحقق من تغييرات miRNAs. هذه الطريقة غير مخصصة لتحليل miRNAs في المصل ، ولكن قد يكون من الممكن استخدامها لهذا عن طريق تعديل البروتوكول.
ويستند الأساس المنطقي لهذه الطريقة إلى التقارير السابقة. استخدمنا أعمدة الدوران لتمزيق البوليمرات الحيوية لتعطيل البوليمرات الحيوية في العينة ، والتي ثبت سابقا أنها تقنية فعالة12. أظهرت التقارير السابقة أيضا دقة توليف cDNA من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام cDNA المحضر كقالب13. كخطوة حاسمة في هذه الطريقة ، يعد تقييم نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل أمرا مهما. من الضروري استبعاد منحنيات التضخيم غير الطبيعية من النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي النظر في التغييرات في الضوابط الداخلية إذا لم يتم الحصول على نتائج مستقرة14.
المشكلة الرئيسية التي يمكن مواجهتها مع هذه الطريقة هي التعبير المنخفض بشكل غير طبيعي عن miRNAs. miRNAs هي مركبات قابلة للتحلل بدرجة عالية ، لذا يجب تنفيذ الطريقة بسرعة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب القضاء على آثار الريبونوكلياز (RNase) في البيئة التجريبية. يجب أن يكون الباحثون دائما على دراية بوجود RNase في الجلد والشعر17. من الضروري ارتداء قفازات وأقنعة وأغطية شعر يمكن التخلص منها لإجراء التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تنظيف معدات المختبرات مثل الماصات الدقيقة وأطراف الماصة وأنابيب التجميع لضمان عدم وجود RNase17. يجب إجراء إلغاء تنشيط RNase باستخدام الأوتوكلاف حسب الضرورة17. خلاف ذلك ، يجب على الباحثين استخدام العناصر المعتمدة الخالية من RNase17. يجب تخزين جميع العينات بشكل صحيح في ظل الظروف الموصى بها لتقليل مخاطر تلوث RNase.
طريقتنا لها ثلاثة قيود مهمة. الأول هو أننا لم نوضح ما إذا كان يمكن تطبيقه على الحيوانات الأخرى والأعضاء الأخرى. هذا مهم لأنه من المعروف أن miRNAs تلعب دورا مهما في خلايا الدم في اعتلال الكلية IgA2،6،7 ، لكننا لم نحقق فيما إذا كان يمكن استخدام طريقتنا في خلايا الدم. ثانيا، قد يكون حجم عينة تجاربنا صغيرا. يجب تحديد حجم العينة اعتمادا على تصميم الدراسة والتحليل الإحصائي والوقت المطلوب والتكاليف المطلوبة. لذلك ، يجب على كل باحث تحديد حجم العينة المناسب قبل البدء في هذه التجربة. ثالثا ، قد تختلف شدة والنمط الظاهري لاعتلال الكلية IgA في الفئران HIGA بين الأفراد9. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم التحقيق بشكل كامل في التحيز بين الجنس والعمر. يوصى بإضافة الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتأكيد شدة والنمط الظاهري لاعتلال الكلية IgA ، إذا لزم الأمر. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بالطرق الأخرى غير تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بما في ذلك المصفوفات الدقيقة ، والنشاف الشمالي ، ومقايسات حماية الريبونوكلياز ، عند الضرورة.
في الختام ، قمنا بتطوير طريقة موثوقة لقياس مستويات التعبير عن miRNAs في كليتي نموذج فأر IgA (فئران HIGA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر سارة ويليامز ، دكتوراه ، من مجموعة Edanz (www.edanzediting.com) لتحرير مسودة هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N.
- Szeto, C. C., Li, P. K.
- Wyatt, R. J., Julian, B. A.
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
