Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של אימונוגלובולין עכברים נפרופתיים

Published: July 8, 2020 doi: 10.3791/61535
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 1
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

Summary

מיקרו-רנ"א מעורבים בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. פיתחנו שיטה אמינה לאיתור רמות ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של עכבר נפרופתיה מסוג IgA (עכברי HIGA). שיטה חדשה זו תקל על בדיקת מעורבות miRNA בנפרופתיה מסוג IgA.

Abstract

אימונוגלובולין A (IgA) נפרופתיה היא סוג של גלומרולונפריטיס ראשונית המאופיינת בתצהיר חריג של IgA, המוביל לאי ספיקת כליות סופנית. בשנים האחרונות דווח על מעורבות של מיקרו-רנ"א (miRNAs) בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. עם זאת, אין שיטה מבוססת ליצירת פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים. לכן, פיתחנו שיטה אמינה לניתוח miRNA בכליה של מודל עכבר IgA (עכבר HIGA). מטרת פרוטוקול זה היא לזהות את רמות הביטוי המשתנות של miRNA בכליות של עכברי HIGA בהשוואה לרמות בכליות של עכברי ביקורת. בקצרה, שיטה זו מורכבת מארבעה שלבים: 1) קבלת דגימות כליה מעכברי HIGA; 2) טיהור RNA כולל מדגימות כליה; 3) סינתזה של דנ"א משלים מרנ"א כולל; ו-4) תגובת שרשרת כמותית של פולימראז בשעתוק לאחור (qRT-PCR) של miRNA. באמצעות שיטה זו זיהינו בהצלחה את רמות הביטוי של מספר miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p) בכליות של עכברי HIGA. שיטה חדשה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אחרים פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA.

Introduction

Immunoglobulin A (IgA) נפרופתיה היא סוג של glomerulonephritis ראשוני המאופיין על ידי תצהיר חריג של IgA באזור mesangial גלומרולרי הכליה 1,2. זהו הנפוץ ביותר של glomerulonephritis הראשוני ומוביל לאי ספיקת כליות סופנית ב 20%-40% מהחולים2. הסיבה עדיין לא ידועה, אך זיהום רירית מתמשך היה מעורב 1,3. קורטיקוסטרואידים, מדכאי חיסון ומעכבי מערכת רנין-אנגיוטנסין הוצעו כשיטות טיפוליות1,3, אך לא נקבעו לחלוטין3. לכן, נדרש מחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה ואת שיטות הטיפול של טיפול נפרופתיה IgA.

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הם רנ"א קטנים ולא מקודדים הממלאים תפקיד חשוב בוויסות ביטוי גנים 4,5. miRNA מדווחים כמעורבים בפתוגנזה של מחלות שונות, וחלקם זוהו כסמנים ביולוגיים של מחלות וסוכנים טיפוליים 4,5. בשנים האחרונות דווח גם על קשר בין miRNAs לבין הפתוגנזה של נפרופתיה IgA 2,6,7. לדוגמה, miR-148b הוכח כמעורב בהפרעות מבניות של IgA בחולים עם נפרופתיה IgA 2,6,7, בעוד miR-148b ו- let-7b תועדו כסמנים ביולוגיים חדשניים לגילוי נפרופתיה IgA7. למרות שהבנת ההשפעות של miRNA על נפרופתיה IgA עשויה לעזור להבהיר עוד יותר אטיולוגיה וטיפול 2, שיטות סטנדרטיות ליצירת פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים טרם נקבעו2.

כאן פיתחנו שיטה פשוטה ואמינה למדידת רמות ביטוי miRNA בכליות של עכבר נפרופתיה IgA (עכברי HIGA). עכבר HIGA הוא זן ddY אופייני המראה רמה גבוהה במיוחד של IgA בסרום ואת התצהיר החריג של IgA בגלומרולי כליות 8,9,10,11. לכן, עכברי HIGA יכולים לשמש כעכבר נפרופתיה IgA מודל 8,9,10,11. השיטה שלנו מורכבת מארבעה שלבים עיקריים: ראשית, קבלת דגימות כליה כירורגית מעכברי HIGA; שנית, הומוגניזציה של דגימות וטיהור הרנ"א הכולל באמצעות עמוד ספין מבוסס קרום סיליקה; שלישית, סינתזה של דנ"א משלים (cDNA) מסך הרנ"א באמצעות שעתוק הפוך; ורביעית, זיהוי רמות הביטוי של miRNA על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בשעתוק לאחור (qRT-PCR). הרציונל לשיטה זו ומהימנות התוצאות מבוססים על דוחות קודמים12,13. אנו מראים כי זוהי טכניקה שימושית למדידה מדויקת של רמות ביטוי miRNA במודל עכבר נפרופתיה IgA, וכי ניתן להשתמש בה כדי להקל על מחקר עתידי של miRNA בנפרופתיה IgA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ועומדים בהנחיות השימוש והטיפול בחיות ניסוי של מדריך האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י לחיות מעבדה.

1. קבלת דגימות כליה מעכברי HIGA

הערה: עכברי HIGA מראים פנוטיפ יציב של נפרופתיה IgA לאחר 25 שבועות של גיל 8,9,10,11. עכברי Balb/c צריכים להיבחר כקבוצת הביקורת 8,9,10,11. התקבלו נקבות עכברי HIGA בנות 25 שבועות (n = 10) ועכברות Balb/c בנות 25 שבועות (n = 10). יש לקבוע מראש את מספר העכברים הדרושים לניסויים. שלב זה דורש כ-7-8 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי Balb/c.

  1. הכינו את הפריטים הבאים: עכברי HIGA (בני 25 שבועות, נקבה), עכברי Balb/c (בני 25 שבועות, נקבה), מכשיר הרדמה בשאיפה, איזופלורן, יריעת שעם, סיכה, מלח חוצץ פוספט (PBS), מזרקי הזרקה, מחטים, מספריים כירורגיים ומלקחיים.
  2. מרדימים עכבר HIGA באמצעות 4%-5% איזופלורן עם מכשיר הרדמה באינהלציה ומרכיבים אותו במצב גבי על יריעת השעם באמצעות פינים. להתאים את ריכוז isoflurane ל 2%-3% כמינון תחזוקה לאחר השראת הרדמה.
    הערה: עומק ההרדמה נשמר ברמה שבה הכאב הקשור להליך הפולשני נעלם לחלוטין. בפרט, ריכוז isoflurane צריך להיות מותאם ל 4-5% בעת כריתת רקמות כגון בית החזה. הסרת שיער ומשחת עיניים אינן חיוניות. אין צורך להרכיב את העכבר על כרית חימום אם ניתן לבצע את ההליך במהירות.
  3. בצע חתך קו אמצע של 3-4 ס"מ של דופן הבטן של העכבר עם מספריים כירורגיים ומלקחיים וזהה בזהירות את שני צידי הכליה.
  4. חותכים את הצלעות והסרעפת עם מספריים כירורגיים ומלקחיים כדי לחשוף את הלב. לאחר חיתוך האטריום הימני, יש להזריק PBS לחדר השמאלי עד שצבע הכליה משתנה לצהוב בהיר (הליך זה אומר שכל גוף העכבר מחורר עם PBS).
  5. חותכים את עורק הכליה, וריד הכליה והשופכן, ומוציאים את הכליה. מחלקים את הכליה לחתיכות של 30 מ"ג לשימוש בשלב הבא.
    הערה: הפתולוגיה של נפרופתיה IgA כוללת בעיקר את glomerulus בקליפת הכליה (החלק החיצוני של הכליה). למרות שקשה להבחין באופן מקרוסקופי ומוחלט בין קליפת המוח לבין המדולה, רצוי לאסוף בעיקר את החלק החיצוני של הכליה. דגימות אלה ניתן לאחסן ב -80 ° C במשך מספר חודשים.

2. טיהור RNA כולל מדגימות כליה

הערה: בשלב זה, ערכת בידוד miRNA זמינה מסחרית משמשת להפקת RNA כולל. בנוסף, ביופולימר גריסה עמוד ספין משמש. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים. ערכת בידוד miRNA מכילה עמוד ספין מבוסס קרום סיליקה, ריאגנטים ליזיס מבוססי פנול/גואנידין, חיץ שטיפה גואנידין/אתנול (חיץ שטיפה 1), חיץ שטיפה אתנול (חיץ שטיפה 2) ומים ללא נוקלאז. שלב זה דורש כ-3 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי ביקורת.

  1. הכינו את הפריטים הבאים: שפופרות איסוף של 1.5 או 2.0 מ"ל, 100% אתנול, כלורופורם, הומוגנייזר סיליקון, מיקרופיפטה, קצות פיפטה, צנטריפוגה, עמוד ספין לגריסת ביופולימר, עמוד ספין מבוסס סיליקה, ריאגנטים ליזיס מבוססי פנול/גואנידין, חיץ שטיפה גואנידין/אתנול (חיץ שטיפה 1), חיץ שטיפה אתנול (חיץ שטיפה 2) ומים ללא נוקלאז.
  2. הומוגניזציה של דגימות כליה של 30 מ"ג באמצעות הומוגנייזר סיליקון ו-700 מיקרוליטר של מגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין בטמפרטורת החדר.
    הערה: ה-miRNA בדגימה פגיעים עד שנחשפו למגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין, ולכן יש לבצע שלבים אלה בהקדם.
  3. מעבירים את הליזט לעמוד הספין הגורס ביופולימר וצנטריפוגות אותו במהירות של 15,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מוסיפים 140 μL כלורופורם לתסנין ומערבבים במרץ במשך 15 שניות. להשאיר במשך 2-3 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12,000 x גרם ב 4 ° C במשך 15 דקות.
  5. מעבירים בעדינות את הסופרנאטנט השקוף מבלי לגעת בשכבה האמצעית לצינור איסוף חדש ומוסיפים את הנפח שנקבע (ראו להלן) של 100% אתנול. מערבולת במשך 5 שניות.
    הערה: נדרש 100% אתנול בנפח של פי 1.5 מהסופרנאטנט המתקבל.
  6. מעבירים את הדגימה (גבול עליון 700 μL) לעמוד ספין מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב-8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
  7. הוסף 700 μL של חיץ כביסה 1 לעמוד הספין מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה את העמוד בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב 8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
  8. הוסף 500 μL של חיץ כביסה 2 לעמוד הסחרור מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב 8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
  9. הוסף 500 μL של חיץ כביסה 2 לעמוד הסחרור מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב 8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
  10. צנטריפוגו שוב את עמוד הסחרור המבוסס על קרום סיליקה מבלי להוסיף דבר כדי להסיר אתנול נוסף, בטמפרטורה של 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לזרוק את התסנין לאחר צנטריפוגה.
  11. שנה את הצינור המחובר לעמודת הסחיטה לצינור איסוף חדש.
  12. הוסף 30 μL של מים נטולי נוקלאז לעמוד הסחרור מבוסס קרום הסיליקה וצנטריפוגה אותו ב 8,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
    הערה: תמיסת 30 μL המתקבלת מכילה ריכוז גבוה של RNA כולל. מדגם זה ניתן לאחסן ב -80 ° C במשך מספר חודשים.

3. סינתזה של cDNA מסך RNA

הערה: בשלב זה, נעשה שימוש בערכת תמלול לאחור הזמינה באופן מסחרי. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים. ערכה זו מכילה תערובת חומצות גרעין, תערובת שעתוק הפוך וחיץ. הליך זה חייב להתבצע על קרח כדי למנוע התקדמות של התגובה. שלב זה דורש כ-3 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי ביקורת.

  1. הכינו את הפריטים הבאים: צינורות איסוף 1.5 מ"ל, צינורות רצועת שמונה בארות, מיקרופיפטים, קצות פיפטה, ספקטרופוטומטר, מים ללא נוקלאז, קרח, תערובת חומצות גרעין, תערובת שעתוק הפוך, חיץ ומחזור תרמי.
  2. למדוד את ריכוז הרנ"א הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, חשב את הנפח הנדרש של מים ללא נוקלאז, כך 12 μL מכיל 1 מיקרוגרם של RNA כולל.
  3. הכינו תערובת אב עם התכולה הבאה: 2.0 μL של תערובת חומצות גרעין, 2.0 μL של תערובת שעתוק לאחור, ו- 4.0 μL של חיץ לסך של 8.0 μL לדגימה.
  4. הוסף 8 μL של תערובת האב לכל באר של שמונה צינורות רצועה באר.
  5. לדלל את סך הרנ"א בנפח המים נטולי הנוקלאז המחושב ב-3.2. לאחר מכן, הוסף 12 μL של תמיסת RNA הכוללת (המכילה 1 מיקרוגרם של RNA כולל) לכל באר של שמונה צינורות רצועה באר.
  6. לדגור את הדגימה ב 8 צינורות רצועת באר ב 37 ° C במשך 60 דקות באמצעות מחזור תרמי. לאחר מכן, לדגור ב 95 ° C במשך 5 דקות באמצעות מחזור תרמי.
    הערה: התמיסה לאחר הדגירה מכילה ריכוז גבוה של cDNA.
  7. העבר תמיסה זו לצינור של 1.5 מ"ל והוסף 200 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.
    הערה: 200 μL המתקבל של פתרון יכול לשמש עבור qRT-PCR כמו cDNA תבנית. מדגם זה ניתן לאחסן ב -80 °C במשך כשנה.

4. qRT-PCR של miRNA

הערה: בשלב זה, נעשה שימוש בערכת PCR זמינה מסחרית. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים. ערכה זו מכילה תערובת PCR, פריימר אוניברסלי ומים ללא נוקלאז. דוגמאות צריך להיות מוכן כפול, ואת הדיוק של התוצאות צריך להיחשב בכל מקרה. רמות הביטוי של miRNA מכומתות בשיטת ΔΔCT. שלב זה דורש כ-4 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי ביקורת.

  1. הכינו את הפריטים הבאים: שפופרת איסוף של 1.5 מ"ל, צלחת תגובה של 96 בארות, סרט דבק לצלחת התגובה של 96 בארות, מיקרופיפטה, קצות פיפטה, תערובת PCR, פריימר אוניברסלי, מים ללא נוקלאז, פריימרים ספציפיים ל-miRNA ומכשיר PCR בזמן אמת.
  2. הכן את תערובת האב עם התוכן הבא: 12.5 μL של תערובת PCR, 2.5 μL של פריימר אוניברסלי, 1.25 μL של 5 μM פריימר ספציפי miRNA, ו 6.25 μL של מים ללא nuclease עבור כל באר.
    הערה: בבדיקה זו נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים ל-miRNA [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p]. RNU6-2 שימש כבקרה אנדוגנית14.
  3. הוסף 22.5 μL של תערובת האב לכל באר של צלחת התגובה 96 באר.
  4. הוסף 2.5 μL של cDNA שהוכן בשלב 3.7 לבאר בודדת של צלחת באר 96.
  5. כסו את צלחת התגובה של באר 96 בסרט הדבקה, ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות של 1,000 x גרם למשך 30 שניות.
  6. הפעל את מכשיר ה- PCR בזמן אמת. תכנת את מכשיר ה- PCR באופן הבא: הפעלה ראשונית ב- 95 ° C למשך 15 דקות, לאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב- 94 ° C למשך 15 שניות, חישול ב- 55 ° C למשך 30 שניות, והרחבה ב- 70 ° C למשך 30 שניות.
  7. כימות ביטוי גנים בשיטת ΔΔCT. רמות ביטוי יחסיות נקבעות כ- 2–ΔΔCT.
    הערה: יש לשקול עקומות הגברה חריגות של PCR לצורך אי הכללה מהתוצאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חקרנו את רמות הביטוי של miRNA בכליות של עכברי HIGA (n=10). תוצאה זו התקבלה לחלוטין על בסיס הפרוטוקול המתואר. הכליות של עכברי Balb/c נבחרו כקבוצת הביקורת (n=10). בשתי הקבוצות נבחרו בני 25 שבועות. רק נקבות עכברי HIGA היו זמינות מהספק. רמות הביטוי של שלוש miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p; איור 1) זוהו, אשר דווח בעבר להיות קשור עם נפרופתיה IgA15,16. רמות ביטוי miRNA יחסיות של שתי הקבוצות הושוו באמצעות מבחן t, כאשר P < 0.05 היה מובהק סטטיסטית. miR-155-5p התבטא ברמות גבוהות פי 3.3 בקבוצת HIGA בהשוואה לקבוצת הביקורת (P < 0.001), בעוד miR-21-5p התבטא ברמות גבוהות פי 1.58 בקבוצת HIGA (P = 0.007). ביטוי miR-146a-5p לא היה שונה באופן משמעותי בין שתי הקבוצות.

Figure 1
איור 1: רמות ביטוי של miRNA בכליות של עכברי HIGA. qRT-PCR קבע את רמות הביטוי היחסיות של miR-155-5p, miR-146a-5p ו- miR-21-5p בעכברי HIGA (n = 10) ובעכברי Balb/c (n = 10). רמות ביטוי יחסיות מוצגות כערכים ממוצעים וכשגיאות תקן. (A) ביטוי miR-155-5p היה גבוה פי 3.3 בקבוצת HIGA (P < 0.001). (B) ביטוי miR-146a-5p לא היה שונה באופן משמעותי בין שתי הקבוצות. (C) ביטוי miR-21-5p היה גבוה פי 1.58 בקבוצת HIGA (P = 0.007). תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת בשעתוק לאחור (qRT-PCR); מיקרו-רנ"א (miRNAs); לא משמעותי (NS); *, עמ' <0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הצלחנו למדוד את רמות הביטוי של miRNA בכליות של מודל עכבר נפרופתיה IgA (עכברי HIGA) באמצעות שיטה חדשה זו. IgA נפרופתיה היא מחלה בלתי מוסברת הזקוקה למחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה שלה ואת המטרות הטיפוליות 1,3. עם זאת, השגת דגימות כליה אנושיות היא פולשנית ביותר. טכניקה חדשה זו היא יתרון בכך שהיא מאפשרת מחקר של נפרופתיה IgA באמצעות בעלי חיים קטנים ואמורה להקל על מחקר עתידי של נפרופתיה IgA ו miRNAs. במחקר עתידי, שיטה זו יכולה להיות מיושמת במחקר של miRNA חדש לטיפול בנפרופתיה IgA. אפנון מלאכותי של miRNA בעכברי HIGA עשוי להשפיע על הפנוטיפ של נפרופתיה IgA. במקרה זה, שיטה זו עשויה להיות שימושית לאימות השינויים של miRNAs. שיטה זו אינה מיועדת לניתוח miRNA בסרום, אך ייתכן שניתן יהיה להשתמש בה לשם כך על ידי שינוי הפרוטוקול.

הרציונל של שיטה זו מבוסס על דיווחים קודמים. השתמשנו בעמודי ספין בגריסת ביופולימרים כדי לשבש ביופולימרים בדגימה, שהוכחה בעבר כטכניקה יעילה12. דיווחים קודמים הדגימו גם את הדיוק של סינתזה cDNA מסך RNA באמצעות שעתוק לאחור וביצוע PCR באמצעות cDNA מוכן כתבנית13. כצעד קריטי בשיטה זו, הערכת תוצאות ה- PCR חשובה. יש צורך להוציא עקומות הגברה חריגות מהתוצאות. בנוסף, יש לשקול שינויים בבקרות אנדוגניות אם לא מתקבלות תוצאות יציבות14.

בעיה מרכזית שניתן להיתקל בה בשיטה זו היא ביטוי נמוך באופן חריג של miRNAs. miRNAs הם תרכובות מתכלות מאוד ולכן השיטה צריכה להתבצע במהירות. בנוסף, יש לבטל את ההשפעות של ריבונוקלאז (RNase) בסביבת הניסוי. חוקרים צריכים תמיד להיות מודעים לנוכחות של RNase בעור ובשיער17. יש צורך ללבוש כפפות חד פעמיות, מסכות וכובעי שיער לניסויים. בנוסף, יש לנקות ציוד מעבדה כגון מיקרופיפטה, קצות פיפטה וצינורות איסוף כדי להבטיח היעדר RNase17. השבתה של RNase באמצעות autoclave צריך להתבצע לפי הצורך17. אחרת, החוקרים צריכים להשתמש בפריטים מאושרים ללא RNase17. כל הדגימות צריכות להיות מאוחסנות כראוי בתנאים המומלצים כדי להפחית את הסיכון לזיהום RNase.

לשיטה שלנו יש שלוש מגבלות חשובות. הראשונה היא שלא הדגמנו אם ניתן ליישם אותה על בעלי חיים אחרים ואיברים אחרים. זה רלוונטי מכיוון שידוע כי miRNA ממלאים תפקיד חשוב בתאי דם בנפרופתיה IgA 2,6,7, אך לא חקרנו אם השיטה שלנו יכולה לשמש בתאי דם. שנית, גודל המדגם של הניסויים שלנו עשוי להיות קטן. גודל המדגם צריך להיקבע בהתאם לתכנון המחקר, ניתוח סטטיסטי, הזמן הנדרש והעלויות הנדרשות. לכן, על כל חוקר לקבוע את גודל המדגם המתאים לפני תחילת הניסוי. שלישית, החומרה והפנוטיפ של נפרופתיה מסוג IgA בעכברי HIGA עשויים להשתנות בין אנשים9. בנוסף, הטיית המין והגיל לא נחקרה במלואה. מומלץ להוסיף אימונוהיסטוכימיה כדי לאשר את חומרת ופנוטיפ של נפרופתיה IgA, במידת הצורך. בנוסף, מומלץ לבצע את השיטות שאינן PCR, כולל מיקרו-מערך, כתמים צפוניים ומבחני הגנה מפני ריבונוקלאז, לפי הצורך.

לסיכום, פיתחנו שיטה אמינה למדידת רמות הביטוי של miRNA בכליות של עכברי IgA (עכברי HIGA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לשרה ויליאמס, PhD, מקבוצת אדנץ (www.edanzediting.com) על עריכת טיוטה של כתב יד זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit Qiagen 218161 Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2) Qiagen MS00033740 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p) Qiagen MS00001701 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p) Qiagen MS00001638 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p) Qiagen MS00009079 miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder Qiagen 79654 biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument software
takara biomasher standard Takara Bio 9790B silicon homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
  2. Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
  3. Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
  4. Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
  5. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
  6. Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
  7. Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
  8. Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
  9. Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
  10. Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
  11. Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
  12. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  13. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  14. Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
  15. Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
  16. Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 161 microRNA נפרופתיה IgA עכבר HIGA qRT-PCR כליות ביטוי
זיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של אימונוגלובולין עכברים נפרופתיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kaneko, S., Yanai, K., Ishii, H.,… More

Kaneko, S., Yanai, K., Ishii, H., Aomatsu, A., Ito, K., Hirai, K., Ookawara, S., Ishibashi, K., Morishita, Y. Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice. J. Vis. Exp. (161), e61535, doi:10.3791/61535 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter