Summary
マイクロRNAはIgA腎症の病態形成に関与しています。我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるマイクロRNA発現レベルを確実に検出する方法を開発しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAの関与をチェックすることを容易にします。
Abstract
免疫グロブリンA(IgA)腎症は、IgAの異常な沈着を特徴とする原発性糸球体腎炎の一種であり、末期腎不全を引き起こします。近年、IgA腎症の病態形成にマイクロRNA(miRNA)の関与が報告されています。しかし、小動物モデルを用いてIgA腎症のmiRNAをプロファイリングする方法は確立されていません。そこで、IgAモデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNAを解析するための信頼性の高い方法を開発しました。このプロトコルの目的は、対照マウスの腎臓におけるレベルと比較した場合に、HIGAマウスの腎臓におけるmiRNAの変化した発現レベルを検出することである。簡単に言うと、この方法は4つのステップで構成されています:1)HIGAマウスから腎臓サンプルを取得します。2)腎臓サンプルからトータルRNAを精製する。3)全RNAから相補的DNAを合成する工程;4)miRNAの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)。この手法を用いて、HIGAマウスの腎臓における複数のmiRNA(miR-155-5p、miR-146a-5p、miR-21-5p)の発現量を検出することに成功しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAをプロファイリングする他の研究にも適用できます。
Introduction
免疫グロブリンA(IgA)腎症は、腎糸球体メサンギウム領域1,2へのIgAの異常な沈着を特徴とする原発性糸球体腎炎の一種です。これは原発性糸球体腎炎の中で最も一般的であり、患者の20%〜40%で末期腎不全を引き起こします2。原因はまだ不明ですが、持続的な粘膜感染が関係しています1,3。コルチコステロイド、免疫抑制剤、およびレニン-アンジオテンシン系阻害剤が治療法として提案されています1,3が、完全には確立されていません3。したがって、IgA腎症の病因と治療法を明らかにするには、さらなる研究が必要です。
マイクロRNA(miRNA)は、遺伝子発現の調節に重要な役割を果たす小さなノンコーディングRNAです4,5。miRNAは様々な疾患の病態形成に関与していることが報告されており、疾患バイオマーカーや治療薬として同定されているものもあります4,5。近年、miRNAとIgA腎症の病因との関連も報告されています2,6,7。例えば、miR-148bはIgA腎症患者のIgAの構造異常に関与していることが示され2,6,7、miR-148bとlet-7bはIgA腎症を検出するための新しいバイオマーカーとして文書化されました7。miRNAがIgA腎症に及ぼす影響を理解することは、病因と治療のさらなる解明に役立つ可能性がありますが2、小動物モデルを用いてIgA腎症のmiRNAをプロファイリングする標準的な方法はまだ確立されていません2。
我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNA発現量を簡便かつ信頼性の高い方法で測定した。HIGAマウスは、腎糸球体8,9,10,11において特に高レベルの血清IgAとIgAの異常沈着を示す特徴的なddY株である。したがって、HIGAマウスは、IgA腎症モデルマウス8、9、10、11として用いることができる。私たちの方法は4つの主要なステップで構成されています:まず、HIGAマウスから腎臓サンプルを外科的に取得します。第二に、サンプルをホモジナイズし、シリカ膜ベースのスピンカラムを使用してトータルRNAを精製します。第三に、逆転写を用いて全RNAから相補的DNA(cDNA)を合成する。第四に、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)によるmiRNAの発現レベルの検出。この方法の理論的根拠と結果の信頼性は、以前の報告12,13に基づいています。本手法は、IgA腎症マウスモデルにおけるmiRNAの発現量を正確に測定するための有用な技術であり、今後のIgA腎症におけるmiRNAの研究に役立つ可能性があることを示しています。
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Protocol
動物実験は、自治医科大学動物倫理委員会の承認を受けており、自治医科大学実験動物ガイドの実験動物の使用と管理に関するガイドラインに準拠しています。
1. HIGAマウスからの腎臓サンプルの採取
注:HIGAマウスは、25週齢8、9、10、11以降に安定したIgA腎症の表現型を示します。Balb / cマウスは、対照群8、9、10、11として選択されるべきである。25週齢の雌性HIGAマウス(n=10)および25週齢の雌性Balb/cマウス(n=10)を得た。実験に必要なマウスの数を事前に決めておく必要があります。このステップは、10匹のHIGAマウスと10匹のBalb / cマウスのサンプルサイズで約7〜8時間かかります。
- HIGAマウス(25週齢、雌)、Balb/cマウス(25週齢、雌)、吸入麻酔器、イソフルラン、コルクシート、ピン、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、注射器、針、手術用ハサミ、鉗子をご用意ください。
- 吸入麻酔装置でイソフルランを4%〜5%使用してHIGAマウスに麻酔をかけ、ピンを使用してコルクシートの背側に取り付けます。イソフルランの濃度を麻酔導入後の維持用量として2%〜3%に調整する。
注:麻酔の深さは、侵襲的処置に伴う痛みが完全に排除されるレベルに維持されます。特に、イソフルラン濃度は、胸部などの組織を切除する際に4〜5%に調整する必要があります。脱毛や眼軟膏は必須ではありません。手順をすばやく実行できる場合は、マウスを加熱パッドに取り付ける必要はありません。 - 外科用ハサミと鉗子でマウスの腹壁を3〜4 cm正中切開し、腎臓の両側を注意深く識別します。
- 肋骨と横隔膜を外科用ハサミと鉗子で切開し、心臓を露出させます。右心房を切開した後、腎臓の色が淡黄色に変わるまで左心室にPBSを注入します(この手順は、マウスの全身にPBSを灌流することを意味します)。
- 腎動脈、腎静脈、尿管を切断し、腎臓を切除します。次のステップで使用するために腎臓を30 mgの小片に分割します。
注:IgA腎症の病理は、主に腎皮質(腎臓の外側部分)の糸球体を含みます。皮質と髄質を巨視的かつ完全に区別することは困難であるが、主に腎臓の外側部分を収集することが望ましい。これらのサンプルは、–80°Cで数ヶ月間保存できます。
2. 腎臓サンプルからのトータルRNAの精製
注:このステップでは、市販のmiRNA単離キットを使用して全RNAを抽出します。また、生体高分子破砕スピンカラムも用いられる。詳細については、 材料表 を参照してください。miRNA単離キットには、シリカ膜ベースのスピンカラム、フェノール/グアニジンベースの溶解試薬、グアニジン/エタノール洗浄バッファー(洗浄バッファー1)、エタノール洗浄バッファー(洗浄バッファー2)、およびヌクレアーゼフリー水が含まれています。このステップは、10匹のHIGAマウスと10匹の対照マウスのサンプルサイズに対して約3時間かかります。
- 1.5 mLまたは2.0 mLの収集チューブ、100%エタノール、クロロホルム、シリコンホモジナイザー、マイクロピペット、ピペットチップ、遠心分離機、生体高分子破砕スピンカラム、シリカメンブレンベースのスピンカラム、フェノール/グアニジンベースの溶解試薬、グアニジン/エタノール洗浄バッファー(洗浄バッファー1)、エタノール洗浄バッファー(洗浄バッファー2)、およびヌクレアーゼフリー水。
- シリコンホモジナイザーと700 μLのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を使用して、室温で30 mgの腎臓サンプルをホモジナイズします。
注:サンプル中のmiRNAは、フェノール/グアニジンベースの溶解試薬にさらされるまで脆弱であるため、これらのステップは迅速に実行する必要があります。 - ライセートをバイオポリマーシュレッダースピンカラムに移し、室温で15,000 x g で2分間遠心分離します。
- ろ液に140 μLのクロロホルムを加え、15秒間激しく混合します。2〜3分間放置した後、12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 中間層に触れずに透明な上清を新しい収集チューブにそっと移し、100%エタノールの決定量(下記参照)を追加します。5秒間の渦。
注:得られた上清の1.5倍の容量の100%エタノールが必要です。 - サンプル(上限700 μL)をシリカメンブレンベースのスピンカラムに移し、サンプルを室温で8,000 x gで15秒間遠心分離します。遠心分離後に濾液を廃棄する。
- 700 μLの洗浄バッファー1をシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、カラムを室温で8,000 x gで15秒間遠心分離します。遠心分離後に濾液を廃棄する。
- 500 μLの洗浄バッファー2をシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、室温で8,000 x gで15秒間遠心分離します。遠心分離後に濾液を廃棄する。
- 500 μLの洗浄バッファー2をシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、室温で8,000 x gで15秒間遠心分離します。遠心分離後に濾液を廃棄する。
- シリカメンブレンベースのスピンカラムを何も添加せずに再度遠心分離し、追加のエタノールを除去し、15,000 x g で室温で1分間遠心分離します。遠心分離後に濾液を捨てる。
- スピンカラムに取り付けられているチューブを新しい回収チューブに交換します。
- ヌクレアーゼフリー水30 μLをシリカメンブレンベースのスピンカラムに加え、室温で8,000 x g で1分間遠心分離します。
注:得られた30 μL溶液には、高濃度のトータルRNAが含まれています。このサンプルは、–80°Cで数ヶ月間保存できます。
3. 全RNAからのcDNA合成
注:このステップでは、市販の逆転写キットが使用されます。詳細については、 材料表 を参照してください。このキットには、核酸ミックス、逆転写酵素ミックス、およびバッファーが含まれています。この手順は、反応の進行を防ぐために氷上で実行する必要があります。このステップは、10匹のHIGAマウスと10匹の対照マウスのサンプルサイズに対して約3時間かかります。
- 1.5 mL 回収チューブ、8 ウェルストリップチューブ、マイクロピペット、ピペットチップ、分光光度計、ヌクレアーゼフリー水、氷、核酸ミックス、逆転写酵素ミックス、バッファー、サーマルサイクラーをご用意ください。
- 分光光度計を用いて全RNAの濃度を測定します。次に、12 μLに1 μgの総RNAが含まれるように、ヌクレアーゼフリー水の必要量を計算します。
- 2.0 μLの核酸ミックス、2.0 μLの逆転写酵素ミックス、および4.0 μLのバッファーを、サンプルあたり合計8.0 μLの内容でマスターミックスを調製します。
- 8 μLのマスターミックスを8ウェルストリップチューブの各ウェルに加えます。
- 3.2で計算されたヌクレアーゼフリー水の量で総RNAを希釈します。次に、12 μLの全RNA溶液(1 μgの総RNAを含む)を8ウェルストリップチューブの各ウェルに追加します。
- サーマルサイクラーを使用して、サンプルを8ウェルストリップチューブで37°Cで60分間インキュベートします。その後、サーマルサイクラーを使用して95°Cで5分間インキュベートします。
注:インキュベーション後の溶液には、高濃度のcDNAが含まれています。 - この溶液を1.5 mLチューブに移し、ヌクレアーゼフリー水200 μLを加えます。
注:得られた200 μLの溶液は、テンプレートcDNAとしてqRT-PCRに使用できます。このサンプルは、–80°Cで約1年間保存できます。
4. マイクロRNAのqRT-PCR
注:このステップでは、市販のPCRキットを使用します。詳細については、 材料表 を参照してください。このキットには、PCRミックス、ユニバーサルプライマー、ヌクレアーゼフリーの水が含まれています。サンプルは重複して準備する必要があり、それぞれの場合に結果の正確さを考慮する必要があります。miRNAの発現レベルは、ΔΔCT法によって定量される。このステップは、10匹のHIGAマウスと10匹の対照マウスのサンプルサイズに対して約4時間かかります。
- 1.5 mL回収チューブ、96ウェル反応プレート、96ウェル反応プレート用接着フィルム、マイクロピペット、ピペットチップ、PCRミックス、ユニバーサルプライマー、ヌクレアーゼフリー水、miRNA特異的プライマー、リアルタイムPCR装置をご用意ください。
- 各ウェルに12.5 μLのPCRミックス、2.5 μLのユニバーサルプライマー、1.25 μLの5 μMのmiRNA特異的プライマー、および6.25 μLのヌクレアーゼフリー水を含むマスターミックスを調製します。
注:このアッセイでは、miRNA[RNA、U6小核2(RNU6-2)、miR-155-5p、miR-146a-5p、およびmiR-21-5p]に特異的なプライマーを使用しました。RNU6-2を内在性コントロール14として用いた。 - 22.5 μLのマスターミックスを96ウェル反応プレートの各ウェルに加えます。
- ステップ3.7で調製した2.5 μLのcDNAを96ウェルプレートの個々のウェルに加えます。
- 96ウェル反応プレートを接着フィルムで覆い、1,000 x g で30秒間遠心分離します。
- リアルタイム PCR 装置を実行します。PCR装置を次のようにプログラムします:95°Cで15分間の初期活性化、次に94°Cで15秒間の変性の40サイクル、55°Cで30秒間のアニーリング、および70°Cで30秒間の伸長。
- ΔΔCT法を用いて遺伝子発現を定量します。相対発現レベルは2–ΔΔCTとして決定されます。
注:異常なPCR増幅曲線は、結果から除外するために考慮する必要があります。
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Representative Results
HIGAマウス(n=10)の腎臓におけるmiRNAの発現量を調べました。この結果は、記載されたプロトコルに完全に基づいて得られた。Balb/cマウスの腎臓を対照として選択した(n=10)。両方のグループで、25週齢が選択されました。雌のHIGAマウスのみがサプライヤーから入手可能でした。3つのmiRNA(miR-155-5p、miR-146a-5p、およびmiR-21-5p; 図1)が検出され、これは以前にIgA腎症に関連することが報告されていた15、16。2つのグループの相対的なmiRNA発現レベルをt検定を使用して比較し、P < 0.05が統計的に有意でした。miR-155-5pは対照群と比較してHIGA群で3.3倍高いレベルで発現し(P < 0.001)、miR-21-5pはHIGA群で1.58倍高いレベルで発現しました(P = 0.007)。miR-146a-5pの発現は両群間で有意差はなかった。
図1:HIGAマウスの腎臓におけるmiRNAの発現量。 qRT-PCRは、HIGAマウス(n = 10)およびBalb/cマウス(n = 10)におけるmiR-155-5p、miR-146a-5p、およびmiR-21-5pの相対発現レベルを測定した。相対発現レベルは平均値と標準誤差として示されます。(A)miR-155-5p発現はHIGA群で3.3倍高かった(P<0.001)。(b)miR-146a-5pの発現は両群間で有意差がなかった。(C)miR-21-5p発現はHIGA群で1.58倍高かった(P=0.007)。定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR);マイクロRNA(マイクロRNA);重要ではない (NS);*、p <0.05。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この新しい手法を用いて、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNAの発現量を測定することができました。IgA腎症は原因不明の疾患であり、その病因と治療標的を明らかにするためにさらなる研究が必要です1,3。ただし、ヒトの腎臓サンプルの取得は非常に侵襲的です。この新しい技術は、小動物を用いたIgA腎症の研究を可能にするという点で有利であり、IgA腎症およびmiRNAの将来の研究を容易にすると予想されます。将来的には、この方法はIgA腎症の治療のための新規miRNAの研究に適用できる可能性があります。HIGAマウスにおけるmiRNAの人工的な調節は、IgA腎症の表現型に影響を与える可能性があります。その場合、この方法はmiRNAの変化を検証するのに役立つ可能性があります。この方法は血清中のmiRNAの解析を目的としたものではありませんが、プロトコルを変更することで利用できる可能性があります。
この方法の理論的根拠は、以前の報告に基づいています。バイオポリマーシュレッダースピンカラムを使用してサンプル中のバイオポリマーを破壊しましたが、これは以前に効果的な技術であることが示されています12。過去の報告では、逆転写を用いて全RNAからcDNAを合成し、調製したcDNAを鋳型としてPCRを行う精度も実証されています13。この方法における重要なステップとして、PCR結果の評価が重要である。異常な増幅曲線を結果から除外する必要があります。さらに、安定した結果が得られない場合は、内在性コントロールの変更を考慮する必要があります14。
この方法では、miRNAの発現が異常に低いことが大きな問題となります。miRNAは分解性の高い化合物であるため、迅速に実行する必要があります。さらに、実験環境におけるリボヌクレアーゼ(RNase)の影響を排除する必要があります。研究者は、皮膚と髪にRNaseが存在することを常に認識する必要があります17。実験には使い捨て手袋、マスク、ヘアキャップの着用が必要です。さらに、マイクロピペット、ピペットチップ、収集チューブなどの実験機器は、RNase17がないことを確認するために洗浄する必要があります。オートクレーブを用いたRNaseの不活性化は、必要に応じて実行する必要があります17。それ以外の場合、研究者はRNaseフリー認定のアイテムを使用する必要があります17。RNase汚染のリスクを減らすために、すべてのサンプルは推奨条件下で適切に保管する必要があります。
この方法には3つの重要な制限があります。1つ目は、他の動物や他の臓器に適用できるかどうかを実証しなかったことです。miRNAはIgA腎症の血球細胞に重要な役割を果たすことが知られているため、これは関連性がありますが2,6,7、本手法が血球に利用できるかどうかは検討していません。第二に、実験のサンプルサイズは小さいかもしれません。サンプルサイズは、研究デザイン、統計分析、必要な時間、および必要なコストに応じて決定する必要があります。したがって、各研究者は、この実験を開始する前に適切なサンプルサイズを決定する必要があります。第三に、HIGAマウスにおけるIgA腎症の重症度および表現型は、個体間で異なり得る9。さらに、性別と年齢の偏りは十分に調査されていません。必要に応じて、IgA腎症の重症度と表現型を確認するために免疫組織化学を追加することをお勧めします。また、PCR以外の方法(マイクロアレイ、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護アッセイなど)も必要に応じて行うことを推奨します。
結論として、IgAモデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるmiRNAの発現量を測定するための信頼性の高い方法を開発しました。
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Disclosures
著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この原稿の草稿を編集してくださったエダンツグループ(www.edanzediting.com)のサラ・ウィリアムズ博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
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