Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Funktionell bedömning av BRCA1-varianter med CRISPR-medierade basredigerare

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

Personer med BRCA1-mutationer har en högre risk att utveckla cancer, vilket motiverar noggrann utvärdering av funktionen hos BRCA1-varianter. Häri beskrev vi ett protokoll för funktionell bedömning av BRCA1-varianter med CRISPR-medierade cytosinbasredigerare som möjliggör riktad C:G till T:A-konvertering i levande celler.

Abstract

Nyligen genomförda studier har undersökt riskerna med BRCA1 genmutationer med hjälp av olika funktionella bedömningsmetoder såsom fluorescerande reporter analyser, embryonala stamcellens livskraft analyser och terapeutiska läkemedelsbaserade känslighetsanalyser. Även om de har förtydligat många BRCA1-varianter, är dessa analyser som inbegriper användning av exogent uttryckta BRCA1-varianter förknippade med överuttrycksproblem och kan inte tillämpas på post-transkriptionell reglering. För att lösa dessa begränsningar har vi tidigare rapporterat en metod för funktionell analys av BRCA1-varianter via CRISPR-medierad cytosinbasredigerare som inducerar riktad nukleotidersättning i levande celler. Med den här metoden identifierade vi varianter vars funktioner förblir tvetydiga, inklusive c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T och c.4986+5G>A, och bekräftade att CRISPR-medierade basredigerare är användbara verktyg för att omklassificera varianterna av osäker betydelse i BRCA1. Här beskriver vi ett protokoll för funktionell analys av BRCA1-varianter med CRISPR-baserad cytosinbasredigerare. Detta protokoll innehåller riktlinjer för val av målplatser, funktionell analys och utvärdering av BRCA1-varianter.

Introduction

Bröstcancer typ 1 mottaglighet genen (BRCA1) är en allmänt känd tumör suppressor gen. Eftersom BRCA1-genen är relaterad till reparation av DNA-skador, skulle mutationer i denna gen leda till en större risk för cancerutveckling hos en individ1. Bröst-, äggstocks-, prostata- och bukspottskörtelcancer är kopplade till ärvda funktionsförlustmutationer (LOF) av BRCA1-genen 2. Funktionell bedömning och identifiering av BRCA1 varianter kan bidra till att förebygga och diagnostisera de olika sjukdomarna. För att ta itu med funktionen hos BRCA1-varianter har flera metoder utvecklats och använts i stor utsträckning för att undersöka patogeniciteten hos BRCA1-varianter som embryonala stamcellens livsduglighetsanalyser, fluorescerande reporteranalyser och terapeutiska läkemedelsbaserade känslighetsanalyser3,4,5,6. Även om dessa metoder har bedömt funktionen hos många BRCA1-varianter, utgör metoderna som involverar exogent uttryckta BRCA1-varianter begränsningar när det gäller överuttryck som kan påverka nedströmsreglering, gendosering och proteinvikning7. Dessutom kan dessa analyser inte utnyttjas till den posttranscriptional förordningen såsom mRNA splitsning, transkription stabilitet och effekt av oöversatta region8,9.

CRISPR-Cas9-systemet möjliggör riktad genomredigering i levande celler och organismer10. Genom en enkelriktad RNA kan Cas9 inducera dubbelsträngsbrytningar (DSB) i kromosomalt DNA vid specifika genomiska lokus för att aktivera två DNA-reparationsvägar: felbenägen nonhomologous end-joining (NHEJ) väg och felfri homologistyrd reparation (HDR) väg11. HDR är en exakt reparationsmekanism; DSB framkallas dock av Cas9 nuclease för HDR resulterar ofta i oönskade införing och borttagning (indel) mutation. Dessutom behöver den homologa donator-DNA-mallar för att reparera DNA-skador och har relativt låg effektivitet. Nyligen har Cas9 nickase (nCas9) smälts med cytidindeaminasdomäner för att rikta in sig på C:G till T:A-substitutioner, utan behov av homologa DNA-mallar och DNA-dubbelsträngsbrott12,13,14,15. Med hjälp av cytosin basredigeraren utvecklade vi en ny metod för funktionell analys av BRCA1 varianter16.

I denna studie använde vi CRISPR-medierad cytosinbasredigerare, BE314, som inducerar effektiva C:G till T:A-punktmutationer, för att genomföra den funktionella bedömningen av BRCA1-varianter och framgångsrikt identifierat funktionerna hos flera BRCA1-varianter (Figur 1).

Figure 1
Figur 1: En översikt över arbetsflödet för funktionell utvärdering. a)Schematiskt som visar den funktionella bedömningen av BRCA1. Eftersom BRCA1:s LOF påverkar cellens livskraft, när BRCA1-mutationen är patogen, dör cellerna när passagenumret ökar. b)Stadier i den funktionella bedömningen av BRCA1. Prickad låda är valfri. Det kan ersättas av co-transfection av gRNA uttrycker och BE3 uttrycker plasmider DNA. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Metod 1 (generering av HAP1-BE3-cellinjer) är valfri. I stället för att konstruera en BE3-uttryckande cellinje kan BE3-kodning av plasmid-DNA samtransfekteras med gRNA-kodning av plasmid-DNA. Andra varianter av cytosin basredigerare, såsom BE4max, kan också användas för mycket effektiv basredigering.

1. Generering av HAP1-BE3 cellinjer

  1. Konstruktion av plasmid-DNA
    1. För att konstruera lentiBE3-blast plasmid-DNA för lentivirusproduktion, förstärk BE3-kodningssekvenserna i pCMV-BE3 (Table of Materials) med hjälp av polymeras med hög återgivning. Designa PCR-primern så att den innehåller överlappande sekvenser av den smälta vektorn (från steg 1.1.2) för isotermisk montering enligtföljande 17:
      primer-F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3".
      primer-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTTCTTGGG-3"
      OBS: Nukleotider som visas i understrukna överlappas med den smälta vektorn och dessa sekvenser kommer att vara specifika för den målvektor som valts av användaren.
    2. Smält lentiCas9-blast(Table of Materials)plasmid-DNA med restriktionsenzymerna XbaI och BamHI (1 enhet per 1 μg) i 1 timme vid 37 °C. Kör den smälta produkten på en 0,8% agarose gel och rena de lämpliga storleksbanden (8,6 kb) med hjälp av en kommersiell gelextraktionssats(Table of Materials).
    3. Klona den förstärkta BE3 PCR-produkten och smält lentiCas9-Blast vektor med hjälp av isotermiska monteringssats (Table of Materials). Använd totalt 0,02-0,5 pmol DNA-fragment och ett 1:3-förhållande av vektor:infoga. Omvandla monteringsprodukten till DH5 alfa-kompetenta celler18. Tillsätt transformatorerna på en agarplatta som innehåller ampicillin (100 μg/ml) och inkubera plattan över natten vid 37 °C.
    4. Plocka flera kolonier och inokulera dem i 4 ml LB (lysogenybuljong) medium som innehåller ampicillin (100 μg/mL) och odla kulturen i en skakande inkubator vid 180 varv/min.
    5. Rena plasmid-DNA med hjälp av ett kommersiellt plasmid-DNA-reningskit (Table of Materials) enligt tillverkarens protokoll.
    6. För att bekräfta DNA-kloningsframgång, analysera BE3-sekvenserna av varje renat plasmid-DNA (från steg 1.1.5) av Sanger-sekvensering med standard och BE3-specifika primers(kompletterande tabell 1) och välj den exakta klonade lentiBE3-blastkonstruktionen.
      OBS: För att analysera resultaten av Sanger-sekvensering rekommenderade vi flera verktyg som BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) och CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. Cellkultur och generering av HAP1-BE3 cellinjer
    1. Underhåll celler i ett felfritt tillstånd och i ett aktivt delningstillstånd. Kultur HAP1-celler i Iscoves modifierade Dulbeccos medium (Table of Materials) som innehåller 10% fetala nötkreatursserum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin. Kultur HEK293T/17 celler i Dulbeccos modifierade Eagle's medium (Table of Materials) som innehåller 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin.
      OBS: HAP1-cell är användbar för genetisk forskning på grund av att den är nästan haploida celler. Cellerna kan dock spontant återgå till ett diploidtillstånd i cellkulturen. Anrikning Hoechst 34580 färgade 1n-populationmed flowcytometry kommer att vara till hjälp för underhåll av haploidy av HAP1 celler19.
    2. Frö 5 x 106 HEK293T/17 celler på en 100 nm skål 1 dag före transfection. På transfectiondagen, transfektera plasmid-DNA (15 μg lentiBE3-blast, 9 μg psPAX2 för virusförpackningar och 6 μg pMD2.G för injektionsflaskans kuvert med2: a generationens lentivirala förpackningssystem) med hjälp av kommersiella transfectionreagenser enligt tillverkarens protokoll (Materialförteckning)20. Byt medium vid 6 h post-transfection och skörda virusinnehållande medium vid 48 h eller 72 h efter transfection. Filtrera supernaten med ett filter på 0,45 μm.
    3. Omvandla de lentivirala partiklarna av BE3 till HAP1-celler vid en MOI (multiplicitet av infektion) på 0, 1. För att justera för en lämplig MOI, använd seriellt utspädda koncentrationer av virus. Ta bort mediet och ersätt det med justerat viralt supernatant och färskt odlingsmedium.
    4. En dag efter transduktion, ändra mediet till 10 μg/ml blasticidin (Table of Materials)-innehållande medium och välj de transducerade cellerna i 3 dagar med blasticidin. Efter blasticidinval väljer du en brunn med ~10% av de överlevande cellerna för nästa steg.
    5. Efter valet av blasticidin, sådd de transducerade cellerna på 96-brunnsplattor med en densitet av 0,5 celler/brunn för att isolera enstaka kloner (t.ex. späd 50 celler i 20 ml (0,5 celler per 200 μL) odlingsmedium och alikvot 200 μL per brunn i 96 brunnsplatta). Inkubera 96-brunnsplattorna i 2 veckor och välj de enda kolonierna för att bekräfta BE3-aktiviteten.
    6. Dela upp de enskilda kolonierna i två uppsättningar, en uppsättning för testning av BE3-aktivitet och andra för underhåll. Omvandla de lentivirala partiklarna av gRNAs till en av uppsättningarna för att bekräfta BE3-aktiviteten. Analysera mutationsfrekvensen för varje koloni med hjälp av T7 endonuclease I (T7E1, Table of Materials)analys eller genom att utföra den riktade djupsekvenseringstekniken (steg 4)21. Välj lämpliga enskilda kloner som är friska och har en mycket aktiv BE3.
      OBS: För att validera exakta mutationsfrekvenser rekommenderar vi den riktade djupa sekvenseringen än T7E1-analysen. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) är väl validerad målplats för BE3.

2. Utformning och konstruktion av BRCA1 med inriktning på gRNAs

Figure 2
Figur 2: Ett exempel på ett gRNA-plasmid-DNA. (A) För att effektivt redigera målsekvensen med BE3 krävs en NGG PAM (CCN PAM) som placerar mål C (mål G) i ett fönster med fem nukleotider. NGG PAM visas i rött och basredigeringsfönstret representeras av en grå ruta. (B) GRNA-sekvensen för c.8047C>T (H1283Y) basredigering indikeras och mål C:G-par visas i rött medan det aktiva fönstret markeras med en grå ruta. För gRNA-kloning läggs de överhängssekvenser som anges i fetstil till vid båda 5ʹ ändarna. Mallar för gRNA genererades genom glödgning de två kompletterande oligonucleotides. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

OBS: Positiva och negativa kontroller av BRCA1-varianter är viktiga. I denna studie används c.5252G>A (R1751Q) och c.4527C>T (Y1509Y) som godartade kontroller. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A och c.3598C>T (Q1200*) används som patogena kontroller. Målsekvenser för varje gRNA anges i kompletterande tabell 1.

  1. Få BRCA1 genomsekvensen från GenBank på NCBI22.
  2. Sök på 20-bp-målplatserna med Protospacer Adjacent Motif (PAM) -sekvensen "NGG" och "CCN" kring mutation av intresse. Mutationen av intresse bör ligga i 4-8 nukleotider i PAM-distala änden av gRNA målsekvenser på grund av det aktiva fönstret i BE3 är 4-8 nukleotider i PAM-distala änden av gRNAmålsekvenser 14. För c.8047C>T (H1283Y)- och c.5252G>A (R1751Q)-targeting gRNAs, 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ och 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ är sekvenserna i fetstil aktiva fönster. C till T och G till A-konverteringar sker med NGG respektive CCN PAM (figur 2A).
    OBS: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 är användbara webbaserade verktyg för gRNA-design.
  3. Beställ två kompletterande oligonukleotider per gRNA; För de främre oligonukleotiderna, tillsätt "CACCG" i 5ʹ-änden av styrsekvensen och lägg till "AAAC" i 5' änden och "C" i 3' änden för de omvända oligonukleotiderna. Dessa ytterligare sekvenser är specifika för destinationen gRNA uttryck vektor (från steg 2.5) som används för detta protokoll, och användare bör justeras för alternativa gRNA uttryck vektorer (Figur 2B).
  4. Återanvänd oligonukleotid i destillerat vatten vid en slutlig koncentration av 100 μM. Blanda de två kompletterande oligonukleotiderna till en slutlig koncentration på 10 μM med T4 Ligation-buffert(Materialförteckning)och värm dem vid 95 °C i 5 minuter och kyl dem vid rumstemperatur för glödgning.
  5. Smält pRG2 med hjälp av restriktionsenzymet BsaI (1 enhet per 1 μg) i 1 timme vid 37 °C (Materialförteckning). Kör den smälta produkten på 1% agarosgel och rena det lämpliga bandet (2,5 kb).
    OBS: Istället för att använda en klassisk matsmältnings- och ligationsmetod kan annan kloningsmetod som Golden Gate-kloning användas.
  6. Ligate den glödgade oligonukleotidduplexen till vektor-DNA med hjälp av den köpta DNA-ligasen (Table of Materials) enligt tillverkarens protokoll och omvandla dem till DH5 alfa-kompetenta celler (Andra E. coli-stammar som ofta används för subkloning kan också användas).
  7. Tillsätt transformatorerna på en agarplatta som innehåller ampicillin (100 μg/ml) och inkubera plattan över natten vid 37 °C. Rena plasmid-DNA från flera transformatorer och analysera deras gRNA-sekvenser genom sangersekvensering med hjälp av primers som primerar vid U6-promotorn (Table of Materials).

3. Skapande av BRCA1-varianter med CRISPR-medierade basredigeringsverktyg

OBS: Om HAP1-BE3-cellinjer inte används kan BE3-kodande plasmid-DNA samtransfekteras med BRCA1-riktatgRNA. Jämfört med samtransfektion av BE3- och gRNA-plasmider inducerar transfection av gRNA-plasmid till HAP-BE3-celler effektiv basredigering upp till 3-faldig vid mållok i våra händer.

  1. Frö 5 x 105 HAP1-BE3-celler (eller HAP1-celler vid samtransfektionsmetoder) per brunn i 24-brunnsplattor 1 dag före transfektion. Vid tidpunkten för transfektionen, kulturceller för att nå en lämplig densitet (70%-80% sammanflöde).
  2. Transfect BRCA1-targeting gRNAs med hjälp av de köpta transfection reagenserna(Table of Materials)enligt tillverkarens protokoll. Använd 1 μg BRCA1-targetinggRNAs (med 1 μg BE3-kodande plasmid-DNA vid samtransfektionsmetoder) för att inducera C:G till T:A-konvertering vid BRCA1-målplatser. Inkubera cellerna vid 37 °C och subkulturen var 3–4:e dag.
  3. Skörda cellpelletsen 3, 10 och 24 dagar efter transfection för att analysera basredigeringseffektivitet (Prover från 3 dagar efter transfection analyseras omklassificering som dag 0-prover).
  4. Extrahera genomiskt DNA med hjälp av genomisk DNA-rening kit (Table of Materials).
    OBS: Vi rekommenderar att du optimerar transfection villkor med variabelt förhållande mellan reagens och DNA. Optimalt tillstånd för HAP1 transfection är 4:1 ration av reagens till DNA i våra händer.

4. Provberedning för nästa generations sekvensering av Illumina (NGS)

Figure 3
Figur 3: Förberedelser för nästa generations sekvensering. 1st PCR primer utformades för att förstärka BRCA1 målplatsen på genomiskt DNA. 2: a PCR primer utformades så att dess sekvenser ligger mer inuti än 1st PCR primer sekvenser. Ytterligare sekvenser som visas som en gul stapel lades till i bådaändarna av 2: a PCR primer för att bifoga de väsentliga sekvenserna för att utföra nästa generations sekvensering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

  1. Designa de1:a PCR-primerna för att förstärka BRCA1-målplatserna. Även om det inte finns några begränsningar för storleken på den1:a PCR-produkten, rekommenderas en produktstorlek på <1 kb för att effektivt förstärka en viss region (figur 3).
  2. Designa de2:a PCR-primerna som finns i1:a PCR-produkten. Tänk på storleken på ampliconen enligt NGS-läslängden (Till exempel bör storleken på ampliconprodukten vara mindre än 300 bp för 2 × 150 bp parkopplad körning för att sammanfoga varje läsning). För att fästa viktiga sekvenser för NGS-analys, lägg till ytterligare sekvenser till 5' slutet av de2: a PCR-primers enligt följande: för de främre primerna, lägg till 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3' sekvenser till 5' änden, och för de omvända primersna, lägg till 5 '-GTGACTGGAGAGAGCAGACGTGCTCTTCCG ATCT-3' sekvenser till 5' slutet.
    OBS: Vi använde kapslad PCR för att minska ampliconen av icke-specifik bindning genom att förhindra primers från att fästa på icke-målsekvens.
  3. Förstärk BRCA1-målplatserna på det genomiska DNA som erhållits från tre tidpunkter. Använd polymeras med hög återgivning enligt tillverkarens protokoll för att minimera PCR-fel. För 1st PCR-reaktionen, använd 100 ng genomiskt DNA för förstärkning över 15 cykler. För2: a PCR-reaktionen, använd 1 μL av 1st PCR-produkten för förstärkning över 20 cykler. Kör 5 μL av2:a PCR-produkten på 2% agarosgel och bekräfta storleken.
  4. För att fästa de väsentliga sekvenserna för NGS-analys, förstärk2: a PCR-produkten med hjälp av de primers som anges nedan. För PCR-reaktionen används 1 μL av den2:a PCR-produkten för förstärkning upp till 30 cykler med polymeras med hög återgivning.
    1. Om du vill utföra multiplexsekvensering för ett stort antal bibliotek som ska slås samman och sekvenseras samtidigt använder du framåtriktade (D501 – D508) och omvända (D701 – D712) primers, som har unik indexsekvens (Kompletterande tabell 1). Förstärk varje prov med hjälp av olika primers-uppsättningar för att genomföra den unika strategin för dubbel indexering.
    2. Kör 5 μL PCR-produkten på 2% agarosgel för att bekräfta storleken och rena ampliconen med hjälp av ett kommersiellt PCR-rengöringskit(Table of Materials). Blanda varje exempel i lika stora mängder för att skapa ett NGS-bibliotek.
  5. Kvantifiera NGS-biblioteket vid 260 nm våglängd med hjälp av spektrofotometrar och späd ut NGS-biblioteket till koncentration av 1 nM med resuspensionbuffert eller 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Förbered 100 μL av biblioteket utspädd till lämplig lastkoncentration beroende på bibliotekstyperna (Förbered till exempel 200 pM av biblioteket för Nextera DNA Flex).
    1. Som en kontroll, kombinera phiX med det utspädda provet som är lämpligt för typen av sats.
    2. Ladda biblioteket på patronen och kör NGS enligt tillverkarens protokoll. Illumina iSeq 100- eller Miseq-system kan sekvensera ampliconer av olika längd upp till 300 bp för enläst eller ihopparad ände. Vi rekommenderade över 10 000 läsningar per mål amplicon för djupgående analys av basredigeringseffektivitet.

5. Analys av basredigeringseffektivitet för funktionell bedömning av BRCA1-varianter

  1. Analysera basredigeringseffektiviteten med MAUND24. Basredigeringseffektiviteten beräknas enligt beskrivningen nedan.
    Equation 1
    Om det finns flera cytosiner i BE3-aktivt fönster beaktas endast C till T-konverteringen som är inriktad på att utvärdera BRCA1-varianten. Om till exempel sekvenserna i BE3:s aktiva fönster är "C4A5T6C7T8"är de möjliga sekvenserna som genereras av basredigering "T4A5T6C7T8", "C4A 5T6T7T8", och "T4A5T6T7T8". Vid denna tidpunkt, om position 4 är den riktade positionen för den önskade BRCA1-varianten, är endast "T4A5T6C7T 8 "-sekvensenövervägd för beräkning av basredigeringseffektivitet.
    OBS: Vi rekommenderar också andra webbverktyg för analys av basredigeringsaktivitet som CRISPResso225och BE-analyzer23.
  2. Verifiera resultaten med hjälp av positiva och negativa kontroller av BRCA1-varianter. Basredigeringseffektiviteten hos den godartade kontrollen bör förbli densamma, medan de av den patogena kontrollen bör minska med tiden.
  3. Beräkna den relativa basredigeringseffektiviteten hos BRCA1-varianter och bestäm deras patogenicitet. De signifikanta skillnaderna mellan dag 0 och dag 21-prover analyseras lämplig statistisk analys såsom t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De experimentella metoder som beskrivs i detta protokoll möjliggör funktionell bedömning av endogena BRCA1 varianter genereras av CRISPR-baserade cytosin bas redaktörer. För att välja lämpliga cellinjer för funktionell bedömning av BRCA1-varianter bör forskare bekräfta att BRCA1 är en viktig gen i de riktade cellinjerna. Till exempel transfected vi först Cas9 och gRNAs till HAP1 cellinjer för att störa BRCA1 och analyserade mutationsfrekvenser genom riktad djup sekvensering. Vi fann att mutationsfrekvenserna minskade avsevärt med tiden i HAP1-cellinjer (Figur 4A). Dessa resultat visade att BRCA1 är viktig gen för cell livskraft i HAP1 cellinjer. För att undersöka om C:G till T:A ersatta varianter påverkar funktionen av BRCA1,plasmids DNA kodning gRNAs, som kunde inducera varje mutation, transfected till HAP1-BE3 cellinjer och substitutionsfrekvenser analyserades. De relativa substitutionsfrekvenserna för c.3598C>T (s. Q1200*), en patogen variant, minskade dramatiskt, medan frekvensen av c.4527C>T (p.Y1509Y), en godartad variant, förblev likartad med tiden (figur 4B). I ClinVar-databasen rapporteras c.154C>T (s. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) och c.5056C>T (p.H1686Y) av BRCA1 som varianter av osäker betydelse. Vi analyserade funktionen hos dessa varianter med hjälp av de metoder som nämns ovan och fann att nukleotid substitutionsfrekvenser för dessa tre varianter minskade på ett tidsberoende sätt (Figur 4B). Från dessa resultat ändrade de tre substitutionerna BRCA1 funktion och kunde kategoriseras som patogena mutationer.

Figure 4
Figur 4: Representativa resultat av funktionell studie av BRCA1 med CRISPR-Cas9-system. (A) BRCA1 störningar påverkar cellens livskraft. HAP1 celler var transfected med plasmid kodning spCas9 och två gRNAs inriktning BRCA1,respektive, och riktade djup sekvensering utfördes för cell livskraft analys. Mutation frekvenser av BRCA1 minskade på ett tidsberoende sätt i celler transfected med två oberoende gRNAs, och mutation frekvenser av CCR5, som användes som en negativ kontroll, förblev densamma över tiden. (B) Funktionella bedömningar av fem BRCA1-varianter. HAP1-BE3 celler var transfected med gRNAs inducera BRCA1 mutationer, respektive, och riktade djupa sekvensering utfördes för cell livskraft analys. De relativa substitutionsfrekvenserna minskade på ett tidsberoende sätt i celler på c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T och c.5056C>T och c.4527C>T förblev desamma. Felstaplar visar standardfelet av medelvärdet. Asterisker betecknar olika P-värden: * P<0.05; ** P<0.005., n.s: inte betydande. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver en enkel metod för funktionella bedömningar av BRCA1 varianter med CRISPR-meditated cytosin bas editor. Protokollet beskriver metoder för utformning av gRNAs vid målloka och konstruktion av de plasmid DNAs från vilka de uttrycks. Cytosinbasredigerare inducerar nukleotidkonvertering i ett aktivt fönster (vid BE3, nukleotider 4-8 i PAM-distala änden av gRNA-målsekvenserna). Forskaren bör noggrant välja målsekvenser eftersom alla cytosiner i aktivt fönster kan ersättas med tyminer. Dessutom, som beskrivs i steg 5, flera cytosiner i ett aktivt fönster bör noggrant analyseras för att utvärdera funktionen av BRCA1 varianter.

Ett av de viktigaste stegen är transfection i målcelllinjen, vilket påverkar den ursprungliga mutationsfrekvensen för BRCA1-funktionella bedömningar. För att förbättra den ursprungliga mutationsfrekvensen bör forskarna optimera leveransmetoderna till den cellinje som är av intresse. Som beskrivs i steg 1 är genereringen av BE3 som uttrycker cellinjer användbart alternativ för att öka den ursprungliga mutationsfrekvensen. Vi rekommenderar inte lentiviral transduktion av gRNA i HAP1-BE3 celler, eftersom konstituerande uttryck för BE3 och gRNA kan orsaka ackumulerande nukleotid omvandling, och dessa resultat stör funktionell bedömning av BRCA1 varianter.

Utöver de BE3-medierade metoder som införts i detta protokoll rekommenderas flera kompletterande metoder för att ytterligare utöka de funktionella bedömningarna av BRCA1-varianter. För det första, som beskrivits ovan, är mutations frekvensen i det första provet viktigt för att erhålla säkra resultat av BRCA1 varianter. För att öka basredigeringseffektiviteten rekommenderas varianter av cytosinbasredigerare, såsom BE4max. För det andra känner BE3 igen mål-DNA-sekvensen genom 5'-NGG-3' PAM-sekvenserna, vilket är en begränsning för att generera olika typer av BRCA1-varianter. Nyligen utvecklade Cas9-varianter med ändrade PAM-sekvenser är användbara alternativ i detta fall för att förlänga målbara BRCA1-varianter 26,27,28. För det tredje inducerar BE3 betydande basredigering på oönskade platser och off-target-effekten kan påverka funktionell bedömning av BRCA1-varianter29,30,31. För att minska be3:s off-target-effekt bör målplatser för gRNAs noggrant väljas utan liknande sekvenser i genomet. SECURE-BE3 eller YE1, som har utvecklats för att minska oönskad basredigering i genom och transkriptom är användbartalternativ 32,33. Forth, en SGE-metod (m. mättnadsgenomredigering) baserad på Cas9-medierad HDR också bra alternativ för funktionell analys av BRCA1-varianter19. Metoden har ingen begränsning för att välja målsekvenser och nukleotidpositioner för BRCA1-varianter. HDR-baserad metod är dock relativt mindre effektiv än basredigerarna och kräver dessutom design och syntes av donatormallar14. Slutligen, patienten härledda BRCA1 varianter inkluderar olika utbud av mutationer såsom punkt mutationer, införanden och borttagningar. Av dessa är punktmutationer en stor population av BRCA1-varianter, som inte bara är C:G till T:A-konvertering, utan också A:T till G:C, C:G till G:C och A:T till T:A-konverteringar. Till funktionella bedömningar av dessa typer av konverteringar är CRISPR-medierade adenosinbasredigerare och Prime Editors värdefulla alternativ34,35. Snabbt utvecklande genomteknik kommer att möjliggöra funktionella bedömningar av mer olika BRCA1-varianter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Koreas nationella forskningsstiftelse (bidrag 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 och 2018R1A5A2020732 till Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Tags

Cancerforskning Utgåva 168 CRISPR-Cas basredigering BE3 BRCA1 funktionell bedömning Genomteknik
Funktionell bedömning av <em>BRCA1-varianter</em> med CRISPR-medierade basredigerare
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G.,… More

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter