Summary
Sporing af individuelle oversættelseshændelser giver mulighed for kinetiske undersøgelser i høj opløsning af cap-afhængige oversættelsesmekanismer. Her demonstrerer vi en in vitro enkeltmolekyleanalyse baseret på billeddiagnostiske interaktioner mellem fluorescerende mærkede antistoffer og epitop-mærkede spirende peptider. Denne metode muliggør enkeltmolekylekarakterisering af initiering og peptidforlængelse kinetik under aktiv in vitro cap-afhængig oversættelse.
Abstract
Cap-afhængig proteinsyntese er den fremherskende oversættelsesvej i eukaryote celler. Mens forskellige biokemiske og genetiske tilgange har tilladt omfattende undersøgelser af cap-afhængig oversættelse og dens regulering, mangler der stadig kinetisk karakterisering af denne oversættelsesvej i høj opløsning. For nylig udviklede vi en in vitro-analyse til måling af cap-afhængige oversættelse kinetik med enkelt-molekyle opløsning. Analysen er baseret på fluorescerende mærket antistofbinding til spirende epitop-mærket polypeptid. Ved at beskringe bindingen og dissociationen af antistoffer til og fra spirende peptid-ribosome-mRNA-komplekser kan oversættelsesprogressionen på individuelle mRNA'er spores. Her præsenterer vi en protokol til etablering af denne analyse, herunder mRNA og PEGylated slide præparater, real-time billeddannelse af oversættelse, og analyse af enkelt molekyle baner. Denne analyse gør det muligt at spore individuelle cap-afhængige oversættelse begivenheder og løser centrale oversættelse kinetik, såsom indledning og forlængelse satser. Analysen kan i vid udstrækning anvendes på særskilte oversættelsessystemer og bør i det store og hele være til gavn for in vitro-undersøgelser af cap-afhængige oversættelseskinetik og translationelle kontrolmekanismer.
Introduction
Oversættelse i eukaryote systemer sker overvejende gennem 7-methylguanosin (m7G) hætteafhængige veje1. Undersøgelser viser , at indledningen af eukaryote oversættelse er hastighedsbegrænsende og et fælles mål for regel2,3,4. Mekanismer til cap-afhængig oversættelse er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af genetiske5, biokemiske6,7,8, strukturelle9og genomiske10 bulk tilgange. Selv om disse metoder har identificeret forskellige mekanismer, der regulerer cap-afhængige indledning, deres opløsning begrænser dem til ensemble gennemsnit af signaler fra heterogene og asynkrone indledning begivenheder. På det seneste er individuelle in vivo-oversættelseshændelser blevet visualiseret ved hjælp af metoder , der måler fluorescerende antistofbinding til epitoper på spirende polypeptider11,12,13,14. Men disse nye tilgange er også begrænset i deres evne til at løse individuelle indledning begivenheder, fordi flere fluorescerende antistoffer skal binde en spirende peptid at tillade enkelt oversættelse begivenheder, der skal løses fra en høj intracellulær fluorescens baggrund. I mange biologiske interaktioner har løst individuelle kinetiske hændelser givet kritisk indsigt i forståelse af komplekse multistep og gentagne biologiske processer, der ikke er mulige at synkronisere på molekylært niveau. Der er behov for nye metoder, der kan spore dynamikken i de enkelte oversættelseshændelser, for at få en bedre forståelse af cap-afhængig indledning og regulering.
Vi har for nylig udviklet en in vitro-analyse, der måler cap-afhængige indledning kinetik med enkelt-molekyle opløsning15. I betragtning af det store antal kendte og ukendte proteinfaktorer, der er involveret i denne indledningsvej3,16, blev enkeltmolekyleanalysen udviklet til at være kompatibel med eksisterende in vitro-cellefri oversættelsessystemer for at drage fordel af deres bevarelse af cellulære faktorer og robust oversættelsesaktivitet17,18,19,20,21,22,23,24,25. Desuden giver brugen af cellefrie oversættelsessystemer mulighed for mere kompatible sammenligninger mellem observationer med et enkelt molekyle og tidligere bulkresultater. Denne tilgang giver en ligetil integration af nye enkelt-molekyle kinetisk indsigt i de eksisterende mekanistiske rammer for cap-afhængige indledning. For at etablere enkeltmolekyleanalysen ændres det traditionelle cellefrie oversættelsessystem på tre måder: en epitopkodningssekvens indsættes i begyndelsen af en reporter mRNA's åbne læseramme (ORF); den 3 'ende af reporter mRNA er biotinyleret til at lette mRNA ende-tøjring til enkelt-molekyle detektion overflade; og fluorescerende mærkede antistoffer suppleres med oversættelsesekstraktet. Disse modifikationer kræver kun grundlæggende molekylærbiologiske teknikker og almindeligt tilgængelige reagenser. Desuden bevarer disse modifikationer og enkeltmolekylebilleddannelsesbetingelserne oversættelseskinetik af massecellefrie oversættelsesreaktioner15.
I denne analyse (Figur 1), 5′-end udjævnet og 3′-end biotinyleret reporter mRNA er immobiliseret til en streptavidin-belagt detektion overflade i et flow kammer. Flowkammeret fyldes derefter med en cellefri oversættelsesblanding suppleret med fluorescerende mærkede antistoffer. Efter at mRNA-oversættelsen har fundet sted for ca. 30-40 codoner neden for epitopsekvensen26,27, kommer epitopen ud af ribosomets udgangstunnel og bliver tilgængelig for at interagere med fluorescerende mærket antistof. Denne interaktion er hurtig, og dens detektion ved hjælp af fluorescensbilledteknikker med et enkelt molekyle gør det muligt at spore oversættelseskinetik med enkeltmolekyleopløsning under aktiv cellefri oversættelse. Denne analyse bør i det store og hele være til gavn for in vitro-undersøgelser af cap-dependent translation kinetik og dens regulering, især for systemer med en fungerende bulk in vitro-analyse.
En forudsætning for at etablere denne enkeltmolekyleanalyse er en fungerende massecellefri oversættelsesanalyse, som kan opnås ved hjælp af oversættelsesekstrakt, der enten er kommercielt tilgængeligt eller tilberedt efter tidligere beskrevne metoder28. Eukaryote oversættelsesekstrakt kan fås fra forskellige celler, herunder svampe, pattedyr og plante28. Til billeddannelse kræver denne analyse et TIRF-mikroskop udstyret med justerbar laserintensitet og hændelsesvinkel, et motoriseret prøvestadie, et motoriseret fluidics-system og prøvetemperaturstyringsenhed. Sådanne krav er generiske for moderne in vitro enkeltmolekyle TIRF eksperimenter og kan opnås anderledes. Eksperimentet præsenteret her bruger en objektiv-type TIRF system, der består af kommercielt tilgængelige mikroskop, software og tilbehør alle opført i tabellen over materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generation af reporter mRNA
- Rediger en DNA-transskription skabelon, der koder en bulk-assay "ukodet" reporter mRNA ved at indsætte en N-terminus epitop tag-kodning sekvens til at generere en DNA transskription skabelon til en "tagged" reporter mRNA (Figur 2A).
BEMÆRK: 3xFLAG/anti-FLAG interaktion anbefales til denne analyse på grund af sin overlegne følsomhed og den korte 3xFLAG tag længde. Analysen er dog kompatibel med andre epitop-/antistofpar. - Syntetiser ukodede og mærkede RNA'er ved hjælp af lineære DNA-skabeloner og et in vitro-transskriptionssæt (se Materialeoversigt). Typisk er 10-20 pmol in vitro transskriberet RNA tilstrækkeligt til efterfølgende RNA-behandling for at muliggøre en systematisk enkeltmolekyleundersøgelse.
- Cap RNA 5 'ende (Figur 2B) med en m7G udjævning kit (se Tabel over materialer)efter fabrikantens anbefaling.
- Biotinylat RNA 3's ende (Figur 2B) ved hjælp af et biotinyleringssæt (se materialetabel)i henhold til den protokol, der følger med sættet. Rensning af RNA'er ved ekstraktion af phenol-chloroform efterfulgt af rensning med en spinkolonne. Elute RNA i 10-20 μL RNase-frit vand. Ca. 40-50 % af det ikke-udjævnede input-RNA genoprettes.
- Vurder RNA's integritet og koncentration ved denaturering af acrylamidgelelektroforese og RNA-farvning som beskrevet tidligere29.
- Udfør massecellefri oversættelse30 med det 3′-end-biotinylerede mærkede reporter mRNA for at bekræfte, at det ændrede mRNA bevarer de oversættelsesegenskaber, der er af interesse. Som et eksempel kan cap-dependent oversættelse bekræftes ved at måle og sammenligne reporteraktiviteter i massecellefri oversættelsesreaktioner med ikke-udjævnede og begrænsede reporter mRNA'er (se Repræsentative resultater).
2. Forberedelse af flowkammer
- Vælg en passende overtrækstykkelse som angivet af mikroskoets målsætningsspecifikationsark. Vælg et glas- eller kvartsdias til henholdsvis tirf-billedsystemer (Objective- eller Prism-Type Total Internal Reflection Fluorescence)31.
- Udfør rengøring, tilsaltning, PEGylation og kammermontering af coverslip og dias efter den protokol, der er beskrevet af Chandradoss et al.32 med følgende ændringer.
- Vask rutsjebaner, der indeholder borede huller i 10% alkalisk flydende vaskemiddel (v/v) i 20 minutter med sonikering. Kombiner dias og coverslips for alle resterende rengøring trin.
- Spring acetone vask trin. Forlæng Piranha ætsning inkubationstid fra 20 min til 1 time. Inkubere den første runde PEGylation for 3 timer. Inkuber anden runde af PEGylationen med MS(PEG)4 i 3 timer.
3. Klargøring af udstyr
- Mindst 3 timer før du udfører et enkeltmolekyleeksperiment, skal du tænde for mikroskopinkubatoren og reducere luftstrømmen til en lav hastighed for at undgå overdreven akustisk forstyrrelse af eksperimenter. Indstil inkubatortemperaturen til den optimale temperatur for det cellefrie oversættelsessystem.
BEMÆRK: Oversættelsen er ekstremt følsom over for temperatur. Den optimale reaktionstemperatur er specifik for hvert celleekstraktsystem. Reaktionstemperaturkarakterisering er et afgørende skridt i udviklingen af et massecellefrit oversættelsessystem. Denne enkeltmolekyleanalyse skal udføres under samme optimale temperatur som den tilsvarende masseoversættelsestilstand. - Mindst 1 time, før du udfører et enkeltmolekyleeksperiment, tænder laseren ved at trykke på laserknappen bag laserboksen, dreje lasersikkerhedstasten og trykke på startknappen. Tænd mikroskopet, og tryk på kontrolpanelet med berøringsskærmen for at vælge billedtilstand, målsætning og filtersæt.
- Tænd EMCCD-kameraet, den forudgående fasecontroller og sprøjtepumpen ved at trykke på deres tænd/sluk-knapper. Tænd computeren og åben software Andor Solis (software 1) til at styre EMCCD kamera, TirfCtrl (software 2) til at styre laseren, PriorTest (software 3) til at styre motoriserede fase, og Coolterm at styre sprøjten pumpen. Lad kameraet køle af og stabilisere sig til den angivne arbejdstemperatur, før dataindsamlingen begynder.
- I software 2 skal du bekræfte, at de korrekte parametre er indstillet til laserbølgelængde, objektiv type og brydningsindeks for glas og prøve. Klik på knappen Opret forbindelse. Hvis du vil indstille laserintensiteten, skal du klikke på knappen Kontrol ud for laserbølgelængden og derefter trække i pop op-vinduet til laserstyringen og trække i intensitetsdiaslinjen. Indstil laseren til den ønskede vinkel ved at trække i fiberpositionsdiaslinjen eller indtaste den tilsvarende indtrængningsdybde. Sørg for, at feltet Lukker er markeret for at opretholde laseren i slukket tilstand, når den ikke er billedbehandling.
BEMÆRK: Åbn og luk laserskoddet ved at markere udløserboksen. Ved den første etablering af analysen bør forskellige laserintensiteter og hændelsesvinkler testes for optimal detektion med et enkelt molekyle. Den optimale laserintensitet balancerer lys enkeltmolekyle fluorescens og hurtig fotobleaching af fluorophorerne. Hændelsesvinklen skal øges ud over den kritiske vinkel for at reducere den høje fluorescerende baggrund fra de spredende mærkede antistoffer, indtil mRNA-bundne antistoffer er klart afløst. Som reference blev en 532 nm laser indstillet til 10 μW ved målet med laserhændelsesvinklen indstillet til 71,5° i en undersøgelse15 ved hjælp af Cy3-mærket anti-FLAG med et mærkningsforhold på 2-7 farvestoffer pr. antistof. - I software 1 skal du vælge Kinetic under Anskaffelsestilstand, indtaste parametrene for eksponeringstid, kinetisk serielængde og EM-gevinstværdi. Vælg mappen, og tildel filnavne til lagring af databilledfilen.
- Indstil sprøjtepumpen til en beskeden til hurtig strømningshastighed for det efterfølgende rørvasktrin.
Pipette en aliquot af 70% ethanol i en microfuge rør, indsætte sprøjte pumpe slange ende i ethanol opløsning, og brug Coolterm at skifte sprøjten pumpen mellem trække og dispensere tilstande tre gange for at vaske slangen. Gentag med RNase-fri vand.
BEMÆRK: Slangelængden skal være lang nok til, at oversættelsesblandingen kan dispenseres ved trin 5 for kun at kontakte slangen, ikke sprøjten. Skyllevolumenet her skal være større end mængden af dispenseret oversættelsesblanding for at sikre, at oversættelsesblandingen ved trin 5 forbliver i kontakt med desinficeret slange. - Når den endelige vandskylning er blevet udleveret, skal du fjerne restvandet fra slangens indersiden ved at duppe slangeenden på en ren vævsservietter. Hold slangeenden tør ved at sætte den i et rent mikrofugerør.
4. Immobilisering af 3′-end biotinyleret mRNA
- Hold celleekstraktet og oversættelsesblandingen frosset på tøris indtil lige før brug. Tø de resterende frosne reagenser op og hold dem på is.
- Placer flowkammeret i mikroskopprøveholderen med dækslet nedad og fastgør det på plads med tape. Brug tape til at dække indløb og afsætningsmuligheder af flow-kanaler, der ikke er i brug.
- Pipette en 1,5 x volumen (i forhold til kanal volumen; gælder også for andre trin i trin 4 og trin 5) på 0,2 mg / mL streptavidin i flowkanalen og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- For at fjerne ubundet streptavidin skal kanalen vaskes tre gange ved at pipette i en 3x volumen T50 vaskebuffer (20 mM Tris HCl, pH 7,0, 50 mM NaCl, 0,2 U/μL RNase-hæmningsreagens) pr. vask.
BEMÆRK: Det er vigtigt at forhindre, at flydende affald strømmer tilbage til kanalen. Hvis strømningskanalens udløb ikke er tilsluttet et affaldsindsamlingsrør, skal du placere et foldet silkepapir i nærheden af stikkontakten for at absorbere den væske, der strømmer ud af kanalen. - Overfør oversættelsesekstraktet, og bland fra tøris til is, og lad dem tø op.
- Sæt en dråbe nedsænkningsolie på målet. Sæt mikroskopprøveholderen med flowkammeret i mikroskopstadiet. Bring målet tæt på coverlip indtil nedsænkning olie på den objektive kontakter coverslip. Flyt prøvestadiet, så flowkanalens position er direkte over den objektive linse.
- Åbn laserskodden i software 2, og juster laserintensitetsniveauet.
- Vælg fanen Fokus på mikroskopets berøringsskærm, og klik på knappen Fokussøgning og Start. Et bip høres, når et fokusplan opnås med succes.
- Billede flowkanaloverfladen i Live-tilstand i software 1. Optimer fokus for et skarpere billede ved at justere den objektive position med den fine trinkontrol på berøringsskærmen.
- I software 3 skal du flytte scenen for at evaluere niveauet af fluorescensbaggrund på forskellige områder af flowkanalens detektionsoverflade. Hvis fluorescensen er lav, skal du fortsætte med forsøget. Hvis fluorescensbaggrunden er for høj, skal du overveje at kassere strømningskanalen.
- I software 2 skal du lukke laserskodden.
- T50-vaskebufferen pipetteres ud fra strømningskanalen og pipetter straks i en 2x volumen biotinyleret mRNA-opløsning til strømningskanalen. Inkuber i 15 min.
BEMÆRK: For hvert parti mRNA-præparat skal mRNA-koncentrationer og inkubationstider testes for at opnå den mRNA-overfladetæthed, der er nødvendig for at detektere et enkelt molekyle. Passende mRNA overfladetæthed formidler antistofbinding, der viser lysstofrør med højst ~5% overlappende (se repræsentative resultater). Som udgangspunkt anbefales biotinyleret mRNA i en koncentration på 2-20 nM. - Vask kanalen tre gange ved at pipettere en 3x volumen oversættelseskompatibel buffer pr. vask.
5. Oversættelse mix samling og levering til en flow kanal for enkelt-molekyle detektion
- På is samles 3x mængder af oversættelsesblandingen30 i et mikrocentrifugerør efter masseoversættelsesprotokollen fra trin 1.7, undtagen udelade mRNA og supplere med en optimeret koncentration af fluorescerende mærkede antistoffer. Drej kort mikrocentrifugerøret for at samle oversættelsesblandingen i bunden af røret.
BEMÆRK: Ved fastsættelsen af analysen testes forskellige antistofkoncentrationer. Den optimale koncentration viser lave mængder uspecifikt antistofbinding til detektionsoverfladen og hurtig antistofbinding til den spirende peptid (se henholdsvis trin 7.1. og 7.2. for assaykalibreringsdetaljer). - Overfør oversættelsesblandingen til indersiden af en 0,7 mL mikrofugerørshætte. Indstil sprøjtepumpen til træktilstand. Sæt pumpeslangenden ind i oversættelsesmikset. Start sprøjteudtrækningen for at samle oversættelsesblandingen i pumpeslangen. Vend sprøjtepumpeindstillingen til dispenseringstilstanden, og indstil flowet til en optimal hastighed for levering af oversættelsesblandinger.
BEMÆRK: Undgå at generere bobler i oversættelsesblandingen, når du overfører den til pumpeslangen. Undgå at trække oversættelsesblandingen for dybt ind i den del af slangen, der ikke blev desinficeret og skyllet i trin 3.6. Ved fastsættelsen af analysen testes forskellige leveringshastigheder for at bestemme den optimale hastighed (se trin 6.2. for nærmere oplysninger om assaykalibrering). - Hvis der er et mellemrum mellem slangeenden og oversættelsesblandingen, skal du starte sprøjtepumpen og lade oversættelsesblandingen nå slangeenden og derefter stoppe sprøjtepumpen.
- Sæt pumpeslangenden ind i flowkanalens indløb. Undgå at indføre luftbobler i oversættelsesmikset, når forbindelsen udføres. Stabilisering af forbindelsen ved at skrue det specialfremstillede metalbeslag på mikroskopprøveholderpladen. Vurder mikroskop fokus og billedbehandling område fluorescens.
BEMÆRK: Slangen kan spændes fast til flowkammeret med en brugerdefineret del som tidligere beskrevet33. Andre typer af fluidics systemer kan også bruges til denne analyse34. Synsfeltet skal se ens ud før og efter tilslutning af slangen. Hvis der opstår flere lysstofrør efter forbindelsen, lækker oversættelsesmikset sandsynligvis fra leveringsslangen. Afhængigt af applikationen kan det være nødvendigt at kassere kanalen med lækket oversættelsesmix. - Bekræft, at parametrene for filmanskaffelse er korrekte, og at der er angivet det relevante filnavn og den relevante mappe til lagring af filer.
- Flyt scenen for at afbilde et område i midten af overfladen til registrering af strømningskanal. Vælg fanen Fortløbende AF på mikroskopets berøringsskærm, og klik på knappen Fokussøgning og Start for at bevare fokuspositionen under eksperimentet. Et bip høres, når et fokusplan opnås med succes.
- Åbn laserskodden i software 2. I software 1 skal du klikke på knappen Tag signal for at starte optagelsen. Efter ca. 5 s optagelse skal du indtaste kommandoen Kør i Coolterm for at levere oversættelsesblandingen til flowkanalen. Optag i op til 2 timer med en tidsopløsning på 0,5-2 s/frame.
BEMÆRK: Den maksimale rækkevidde af dataindsamling afhænger af, hvor hurtigt oversættelsesekstraktet mister aktivitet over tid, hvilket bekvemt kan karakteriseres ved at udføre massecellefri oversættelse med luciferase reporter mRNA og måle luciferaseaktivitet i oversættelsesreaktionerne på forskellige tidspunkter35. - Når dataindsamlingen er færdig, skal du slukke for laseren, slukke for Continuous AF på mikroskopets betjeningsberøringsskærm og adskille slangen fra flowkammeret.
- Rør oversættelsesblandingen ud fra flowkanalindløbet, overfør den til et mikrofugerør, og fastfrys opløsningen ved at placere røret i flydende nitrogen. Senere opbevares ved -80 °C.
- Vask sprøjtepumpen tre gange med RNase-frit vand, derefter tre gange med 70% ethanol. Træk 70% ethanol tilbage i sprøjtepumpens slange til opbevaring.
- Sluk for mikroskopet og alt tilbehør. Ryd op.
6. Dataanalyse
BEMÆRK: Dataanalyse for denne analyse kræver almindelige metoder i enkeltmolekyle biofysiske undersøgelser. Alle beregningskrævende trin kan opnås ved hjælp af eksisterende algoritmer og software (referencer er inkluderet nedenfor på deres tilsvarende trin).
- Valgfrit: Hvis det er relevant, skal du konvertere den hentede billedseriefil til et format, der er kompatibelt med den valgte billedbehandlingssoftware eller programmeringssprog.
- Startpunktet for oversættelsesreaktionen og reagensudvekslingstiden bestemmes.
BEMÆRK: På grund af de diffuserende fluorescerende antistoffer i oversættelsesmikset øges baggrundsfluorescensintensiteten i et afbildet område under udskiftningen af reagens i kanalen fra oversættelseskompatibel buffer til oversættelsesblanding. Udgangspunktet for oversættelsesreaktionen angives som det tidspunkt, hvor reagensudvekslingen er afsluttet. Dette færdiggørelsespunkt findes ved at måle baggrundsfluorescensintensiteten under leveringen af oversættelsesblandingen og identificere det tidspunkt, hvor den stigende fluorescensintensitet plateauer15, som beskrevet nedenfor.- Beregn det samlede fluorescensantal pr. billedramme, og plot den tilsvarende tidsprofil. Identificer den pludselige stigning i den samlede fluorescens i tidsprofilplottet.
BEMÆRK: Den samlede fluorescensforøgelse skyldes den stigende koncentration af fluorescerende mærket antistof under reagensudvekslingen. - Identificer slutpunktet for den samlede fluorescensforøgelsesfase, og sæt dette tidspunkt som udgangspunkt (dvs. tid 0) for oversættelsesreaktionen. Identificer både start- og slutpunkterne for den samlede fluorescensforøgelsesfase, og angiv tidsforskellen som reagensudvekslingstid.
BEMÆRK: Det samlede tidsrum for reagensudveksling afhænger af flowkanaldimensionerne og den valgte strømningshastighed. Det er muligt, at nogle oversættelsesfaktorer kan begynde at binde sig til mRNA, før reagensudvekslingen er afsluttet, hvilket kan reducere opløsningen af den bestemte første runde-starttid. Det anbefales derfor at teste forskellige strømningshastigheder, når der opsættes analysen, og vælge strømningshastigheder, der tillader færdiggørelse af reagensudveksling inden for 3-4 s for dataopsamlingshastigheder på 0,5-2 s/frame.
- Beregn det samlede fluorescensantal pr. billedramme, og plot den tilsvarende tidsprofil. Identificer den pludselige stigning i den samlede fluorescens i tidsprofilplottet.
- Valgfrit: Udfør korrektion af filmdrift.
BEMÆRK: Placeringen af bundne antistoffer i databilledet kan ændre sig over tid på grund af drift af mikroskopdele og tilbehør. Drift, der er visuelt mærkbar i en film, kræver korrektion, før du går videre med dataanalyse. Flere rumlige drift korrektion algoritmer og scripts er tilgængelige36,37,38.- I hvert billede skal du finde de lokale maksimumværdier i pixelantal for at bestemme placeringen af bundne antistoffer i hver ramme med nøjagtighed på pixelniveau. Angiv en tærskel for pixeltællingen, så kun pletter, der ligger klart over baggrundsstøjen, vælges.
- Beregn ændringerne af individuelle antistofpositioner i hver retning mellem to på hinanden følgende billedrammer.
- Plot histogrammet af antistof positionelle ændringer mellem to på hinanden følgende rammer og gøre det separat for hver retning. Gaussian passer hver histogram og indstille den midterste position af toppe som retningsbestemt drift mellem to på hinanden følgende rammer.
- Hvis du vil modvirke den observerede afdrift, skal du flytte hver billedramme i den modsatte retning med den beregnede afdriftsmængde.
- Konstruere enkelt-molekyle baner.
BEMÆRK: Detektions-/sporingssoftware er tilgængelig til at identificere lyspunkter og udtrække deres intensiteter fra databilledserie39,40.- Identificere antistofpositioner som beskrevet i trin 6.3.1.
BEMÆRK: Visuel inspektion anbefales for at sikre, at den valgte tærskel ikke giver anledning til overdreven over- eller underplukning af partikler. Visuel inspektion kan opnås ved at overlejre de identificerede centroidpositioner over hver billedramme og visuelt vurdere deres samtykke (se Repræsentative resultater). - Kombiner de plukkede partikler fra alle rammer og fjern de overflødige partikelpositioner.
- Visuelt inspicere billederne af bundne antistoffer og vælge et firkantet område omslutter pixels med tæller, der er klart over baggrunden og repræsentative for individuelt bundet antistof.
BEMÆRK: Punktspredningsfunktionen (dvs. kvadratets størrelse for et enkelt molekyle) bestemmes af den optiske opsætning og detektorens pixelstørrelse. - For hver partikelposition skal du konstruere en enkeltmolekylebane ved at beregne den samlede intensitet af alle pixels i det firkantede område omkring partikelpositionen. Baner er konstrueret til hver position, ramme for ramme og for hele datafilmen.
- Identificere antistofpositioner som beskrevet i trin 6.3.1.
- Valgfrit: Påfør et ikke-lineært fremadgående filter41 for at reducere baggrundsstøj i enkeltmolekylebaner.
- Valgfrit: Digitaliser baner med eksisterende trinregistreringsalgoritmer42,43,44,45.
BEMÆRK: Valget af trindetekteringsalgoritme afhænger af kompleksiteten af enkeltmolekyledynamikken. For det enkleste scenario med kun isoleret ribosomoversættelse (dvs. ingen polysomdannelse) og godt signal til støjforhold er en tærskelpåføring til fluorescenstællingerne tilstrækkelig til at identificere tidspunktet for antistofbindings- og dissociationshændelser i enkeltmolekylebanerne. Visuel inspektion af mindst 100 baner for hver tilstand anbefales for at sikre, at banetrinnene er blevet passende udvalgt af en trindetekteringsstrategi. - Bestem tidspunktet for den første antistofbindingshændelse for hver bane (dvs. første ankomsttid, t1), enten ved hjælp af digitaliserede baner eller ved anvendelse af en tærskel på ikke-digitiserede baner.
BEMÆRK: Medianværdien af den første ankomsttidsfordeling kan sammenlignes mellem forskellige oversættelsesforhold. Alternativt kan den første ankomsttidsfordeling monteres på en forskudt (3-parameter) log-normal funktion for at bestemme middelværdien15 <t1>. Da den første ankomsttidsfordeling typisk er skæv og har en lang hale, skal du ikke beregne gennemsnittet ved direkte gennemsnit over de observerede første ankomsttider. - Valgfrit: Dvæletidsanalyse og beregning af gennemsnitlig peptidsyntesehastighed.
- Brug digitaliserede baner til at identificere monosome (enkelt ribosom) oversættelseshændelser i hver bane, og beregn de enkelte bindingshændelsesbotider som tidsforskellen mellem tilsvarende antistofbindings- og dissociationshændelser.
BEMÆRK: Trindetekteringsalgoritmer til digitalisering af baner er generelt mindre pålidelige, når flere molekylære hændelser overlapper hinanden med tiden. Det anbefales derfor at udelukke polysomhændelser fra analyse af opholdstid. For meget aktive oversættelsessystemer, der er beriget med polysomhændelser og sjældent viser monosome hændelser, kan en blanding af mærkede og umærkede antistoffer bruges til at øge chancen for at observere isolerede oversættelseshændelser i enkeltmolekylebaner. - Tilpas fordelingen til en log-normal funktion og brug den monterede funktion til at beregne den gennemsnitlige opholdstid.
BEMÆRK: Det anbefales ikke at beregne middelværdi direkte ved at beregne gennemsnittet af de observerede opholdstider, fordi fordelingerne af opholdstid typisk er skæve med lange haler. - Det bestemmes, hvor mange aminosyrer der oversættes under den antistofbindingsbotid ved at trække summen af epitop aminosyrelængden og 35 (den gennemsnitlige aminosyrelængde af spirende peptid i ribosomets udgangstunnel) fra det samlede antal ORF-codoner.
- For at bestemme den gennemsnitlige peptidsyntesehastighed skal du dividere antallet af oversatte aminosyrer med den gennemsnitlige opholdstid.
- Brug digitaliserede baner til at identificere monosome (enkelt ribosom) oversættelseshændelser i hver bane, og beregn de enkelte bindingshændelsesbotider som tidsforskellen mellem tilsvarende antistofbindings- og dissociationshændelser.
- Valgfrit: Beregning af den gennemsnitlige starttid for første runde (<t1_I>).
BEMÆRK: Indlednings- og forlængelsesbetingelser, såsom konteksten for initieringsstedets sekvens og kodningssekvensen, bevares generelt bevidst til undersøgelser af indledningskinetik. Derfor er den gennemsnitlige første ankomsttid <t1> fra trin 6.7. kan bruges direkte til at beregne ændringen i første runde indledning kinetik mellem forskellige betingelser. Følgende korrektion er kun nødvendig for at bestemme den faktiske værdi af første rundes initieringstid.- Summen af epitoplængden og 35 (den gennemsnitlige aminosyrelængde af spirende peptid i ribosomudgangstunnelen) divideres med den gennemsnitlige peptidsyntesehastighed (fra trin 6.8.4.) for at beregne den gennemsnitlige peptidforlængelsestid for dette N-terminalområde (<t1_tag>).
- Da det første ankomsttidspunkt er summen af første rundes starttidspunkt og t1_tag, skal du trække <t1_tag> fra den gennemsnitlige første ankomsttid <t1> for at beregne den gennemsnitlige første runde-starttid <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag>
7. Assay kalibrering
BEMÆRK: Udfør følgende kalibreringstrin, når analysen først fastslås.
- Hvis du vil undersøge antistofbindingsspecifikiteten, skal du udføre protokoltrinnene i afsnit 4 og 5 separat for ukodede og mærkede mRNA'er (Figur 2). Antistofbindingsniveauerne i kanaler med disse respektive mRNA'er repræsenterer omfanget af uspecifikt antistofbinding til detektionsoverfladen og specifik antistofbinding til spirende peptid.
BEMÆRK: Det specifikke til ikke-specifikke bindingsforhold anbefales at være >10 og kan øges med forskellige overfladetolerationsstrategier, lavere antistofkoncentration eller højere mRNA-overfladetæthed. - Hvis du vil måle antistofbindingshastigheden, skal du udføre protokollen med et ekstra trin mellem trin 4 og trin 5.
- Efter trin 4 inkuber kanalen med oversættelsesblanding, der mangler antistof til at prægenerere mRNA/ribosome/peptidkomplekser.
- Fortsæt derefter til trin 5 og flow antistof-suppleret oversættelse blanding i kanalen.
- Kvantificere den gennemsnitlige antistofbindingshastighed til prægenereret spirende peptid med eksponentiel tilpasning til første ankomsttid histogram.
BEMÆRK: Antistofbinding til forgeneret peptid skal være hurtig i rækkefølge efter sekunder og bør være hurtigere end oversættelseskinetik. En højere antistofkoncentration kan anvendes til at øge antistofbindingshastigheden.
- Fotostability af fluorophore-mærket antistof.
- Forbered et dias i overensstemmelse med protokollen i trin 2, men spring PEGylation-trinnet over. Saml flowkammeret efter tilsaltningstrinnet. Silanbelægningen giver mulighed for effektiv uspecifik antistofbinding til detektionsoverfladen.
- Tilsæt de fluorescerende-mærkede antistoffer i kanalen for at opnå enkeltmolekyletæthed af uspecifikt antistofbinding til detektionsoverfladen. Begynd med at tilføje fluorescerende mærket antistof, der er stærkt fortyndet i T50 vaskebuffer og gradvist øge antistofkoncentrationen, indtil den ønskede enkeltmolekyletæthed er opnået.
- Billede detektionsfladen, indtil det meste af antistoffets fluorescens ikke længere kan påvises.
- Plot det samlede antal synlige antistoffer over tid for at vurdere antallet af antistof fluorescens tab på grund af fluorophore photobleaching.
BEMÆRK: Antistofmærkning giver typisk flere fluorophorer pr. antistof. Individuelle antistoffer forbliver påviselige, indtil alle konjugerede fluorophores photobleach.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den beskrevne protokol muliggør billeddannelse af individuelle antistof interaktioner med spirende N-terminal-mærkede polypeptider med enkelt-molekyle opløsning under aktiv celle-fri oversættelse af 3 'end-bundet reporter mRNA (Figur 1). Der rapporteres om et minimalt demonstrationseksperiment med brug af tre syntetiske mRNA'er: LUC (kodning af umærket luciferase), LUCFLAG (kodning af 3xFLAG-mærket luciferase) og hp-LUCFLAG (LUCFLAG med en stabil stængelsløjfe i 5's lederregion) ( Figur2C). Brugen af luciferase-kodning mRNA muliggør sammenligninger mellem enkeltmolekyle observationer og bulk luminescens målinger. Integriteten af 3' biotinyleret mRNA blev vurderet ved denaturering af polyacrylamidgelelektrophoresis (PAGE) og RNA-farvning. MRNA af god kvalitet viser et enkelt rent bånd og bør ikke vise yderligere hurtigere migreringssignaler(figur 3A). Saccharomyces cerevisiae oversættelsesekstrakt blev brugt her og forberedt efter en protokol, der tidligere blev beskrevet30 og ændret15. Massemålinger af luciferaseaktivitet i cellefri oversættelsesreaktioner med gærekstraktet og biotinyleret LUCFLAG mRNA, der enten mangler eller indeholder en m 7G-hætte,viser cap stimulation af LUCFLAG mRNA-oversættelse (Figur 3B).
Til billeddannelse med et enkelt molekyle blev oversættelsesekstrakt suppleret med 67 nM Cy3-mærket anti-FLAG antistof (Cy3-αFLAG). Dette antistof havde et højt mærkningsforhold på 2-7 farvestoffer pr. antistof. Laseren på 532 nm blev sat til 10 μW ved målet. Laserhændelsesvinklen blev indstillet til 71,5°, hvilket var større end den kritiske vinkel på 63,8° for vores opsætning. Et lavt niveau af fluorescens blev afbildet fra detektionsoverflader, der indeholder mRNA, men mangler oversættelsesblanding (Figur 4A). For kanaldimensioner på ca. 2 mm (bredde) x 50 μm (dybde) x 24 mm (længde) gav en strømningsleveringshastighed på 150 μl/min en reagensvekslingstid på 3 – 4 s. Inden for 5 s af oversættelse mix levering, baggrunden fluorescens niveau stiger på grund af diffuserende fluorescerende antistoffer. Ca. 2 minutter efter oversættelse mix levering til LUCFLAG mRNA-holdige kanaler, Cy3 pletter begyndte at dukke op i et synsfelt og fortsatte med at akkumulere i ~ 30 min (Figur 4B). Det uspecifikke antistofbinding til overfladen, målt ved hjælp af det 3xFLAG-manglende LUC mRNA (Figur 2C), forblev på et meget lavt niveau15. Signalerne fra mRNA/ribosome/peptid-bundet Cy3- αFLAG var tydeligt synlige med den optimerede laser hændelse vinkel, men kunne maskeres af en høj fluorescens baggrund med lavere laser hændelse vinkler (Figur 4C).
For at analysere Cy3-αFLAG-bindingshændelser blev fluorescensintensiteterne for udvalgte Cy3-αFLAG-pletter (Figur 5A) beregnet ramme for ramme for hele filmen og derefter forbundet til at danne en intensitetsbane (Figur 5B). Rå baner kan virke støjende og kan kræve raffinement med et ikke-lineært fremadgående filter for at reducere baggrundsstøj41. Yderligere raffinement kunne opnås ved hjælp af trindetekteringsalgoritmer til digitalisering af bane42. For alle baner forekommer der en universel stigning i baggrundsfluorescensniveauet under reagensudveksling på grund af de spredende fluorescerende antistoffer i oversættelsesmikset (figur 5B). Antistofbinding til en spirende polypeptid forårsagede en øjeblikkelig stigning i fluorescens, mens antistof/polypeptidafkobling fra mRNA forårsager et øjeblikkeligt fluorescensfald (Figur 5B).
Dvæletiden for antistofbinding kan bruges til at måle den samlede afkodningstid for en åben læseramme. Dvaletiden histogram for LUCFLAG mRNA passer til en log-normal fordeling (Figur 6A) og gav en peptidsyntesehastighed på 2,5 ± 0,1 aminosyrer pr. sekund15. Den første ankomsttid histogram passer til en forskudt (3-parameter) log-normal funktion(Figur 6B). Den brede spredning af første ankomsttid histogram viser den høje grad af heterogenitet i enkelt mRNA oversættelse aktivitet. Histogrammet indikerede, at den første peptidsyntesebegivenhed på enkelte LUCFLAG mRNA-molekyler kunne begynde allerede kl. 2 min. og så sent som 20 minutter efter levering af oversættelsesblandinger (Figur 6B). Sammenlignet med oversættelsen med LUCFLAG mRNA viste første ankomsttidspunkt histogram med hp-LUCFLAG mRNA-oversættelse langsommere antistofbinding ( figur7A). Brug af masselysemålinger fra cellefri oversættelsesreaktioner med de samme mRNA'er løser imidlertid ikke forskelle i oversættelseskinetik (figur 7B, C). Disse resultater viser den højere opløsning af vores metode sammenlignet med bulk kinetiske luciferase aktivitetsmålinger til påvisning af små ændringer i initiering kinetik.
Figur 1: Protokolrutediagram. Skematiske repræsentationer af coverlip og slide forberedelse, enkelt-molekyle kammer samling, TIRF billeddannelse og dataindsamling, og dataanalyse trin er vist. TIRF-billedtrinnet omfatter skematiske skildringer af mRNA-immobilisering og oversættelse i en flowkanal. Detektionsoverfladekomponenter, fluorescerende mærket antistof og celleekstraktkomponenter er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: mRNA-design til enkeltmolekyleanalysen. (A) For at tilpasse en masseoversættelsesanalyse til enkeltmolekyleanalysen blev DNA-skabelonen for bulkreporterEN ORF ændret med en N-terminal epitop-tagsekvensindsættelse for at generere en mærket reporter-kodning ORF. ORF- og N-terminal-kodekodningsområder er angivet. (B)mRNA'er var 5'-m7G udjævnet for at tillade cap-afhængige oversættelse og 3′-biotinyleret for deres immobilisering til enkelt-molekyle detektion overflade. 5'-m7G cap og 3′-biotin er angivet på ukodede og mærkede ORF RNAs. (C) Luciferase-kodning mRNA'er blev brugt til at demonstrere enkeltmolekyleanalysen. LUC- og LUCFLAG mRNA'er koder luciferase, der mangler og indeholder henholdsvis en N-terminal 3xFLAG-kode. hp-LUCFLAG mRNA indeholder en ekstra indsættelse, der introducerer en hårnål sekundær struktur i LUCFLAG mRNA 5′-leder. Hårnålen termo ustabilitet, 3'-poly (A) hale, og 3'-biotin er angivet. Alle tre mRNA'er omfattede en 30 nt 3′-poly(A) hale for mere effektiv cap-afhængige oversættelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Enkeltmolekyle reporter mRNA integritet og bulk oversættelse. (A) Repræsentativ denaturering PAGE billeddannelse af enkelt-molekyle reporter mRNA. 5'-m7G udjævnet og 3′-biotinyleret LUCFLAG mRNA blev indlæst på en denaturering 10% polyacrylamid gel ved siden af en RNA stigen. (B) Enkeltmolekyle reporter mRNA bevaret 5 'cap-afhængighed i bulk celle-fri oversættelse reaktioner. 3′-biotinyleret LUCFLAG mRNA, der enten manglede (-cap) eller indeholdt (+ cap) en 5'-m7G cap blev oversat i S. cerevisiae oversættelse ekstrakt i 30 min ved 25 °C. Luciferase aktivitet blev målt fra to uafhængige reaktioner og normaliseret til aktiviteten med -cap mRNA, som er vilkårligt indstillet til 1,0. Standardafvigelser fra middelværdier angives med fejllinjer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Billeddannelse af detektionsoverflader, der indeholder immobiliseret mRNA. (A)Baggrundslyscens, hvis der ikke findes oversættelsesblanding. (B) Cy3 fluorescerende pletter i et synsfelt 30 minutter efter leveringen af oversættelsesblandingen og med en optimeret laserhændelsesvinkel. (C) Afbildet synsfelt 30 minutter efter levering af oversættelsesblanding og med en lav laserhændelsesvinkel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Billedanalyse. (A) Cy3 pletter i et synsfelt uden (venstre panel) eller med (højre panel) spot markering. (B) Eksempel på enkeltmolekylebane for en valgt Cy3-plet. Den sorte pil angiver stigningen i baggrundsfluorescens på grund af spredende antistof under levering af oversættelsesblandinger. Den grønne pil angiver den pludselige stigning i fluorescensintensiteten på grund af Cy3-αFLAG-binding. Den røde pil indikerer det pludselige fald i fluorescensintensiteten på grund af Cy3-αFLAG/nascent peptidafkobling fra mRNA. Opholdstiden for en Cy3-αFLAG-bindingshændelse er angivet med en dobbeltpil. Rå, filtrerede og digitaliserede data er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kinetisk analyse af Cy3-αFLAG-binding med LUCFLAG mRNA-oversættelse. (A) Cy3-αFLAG bindende opholdstid histogram passer til en log-normal fordeling. (B) Cy3-αFLAG-bindingen første ankomsttid histogram passer til en forskudt (3-parameter) log-normal funktion. Tilpasset fra Wang et al.15 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Analysen med et enkelt molekyle har en højere opløsning for initieringskinetik end masselyslysningsanalysen. (A)Første ankomsttid histogrammer for Cy3-αFLAG bindende med oversættelse af LUCFLAG og hp-LUCFLAG mRNAs afslørede langsommere indledning forårsaget af en lille hårnål struktur i mRNA 5′-leder. N = 10650 baner (LUCFLAG), kombineret fra 3 datasæt og N = 4079 baner (hp-LUCFLAG), kombineret fra 2 datasæt. (B,C) Masse luciferase aktivitet assay kinetiske målinger ikke løse forskelle i indledningen kinetik for LUCFLAG (N = 9 datasæt) og hp-LUCFLAG (N = 6 datasæt) mRNA oversættelse. (B) Masse luminescenskinetik. (C) Scatter plots af første runde oversættelse gange bestemt af gaussiske montering til den anden afledte af luminescens kinetik kurver i (B), som beskrevet af Vassilenko et al. 46. De røde cirkler og bjælker i (C) repræsenterer henholdsvis middelværdien og standardafvigelsen for den beregnede oversættelsestid for første runde. Tilpasset fra Wang et al.15 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I sammenligning med typiske in vitro TIRF enkeltmolekyle eksperimenter, enkelt-molekyle billeddannelse med analysen beskrevet her er desuden kompliceret på grund af brugen af celleekstrakt og en høj koncentration af fluorescerende mærket antistof. Sammenlignet med den mere almindelige praksis med en runde af overflade PEGylation reducerer en anden runde pegylation (trin 2) i høj grad uspecifik antistofbinding til detektionsoverflade15. Den høje koncentration af diffuserende fluorescerende antistoffer forårsager en ekstremt høj fluorescerende baggrund, der maskerer enkeltmolekyledetektering af antistofbinding. For at reducere denne fluorescerende baggrund øges laserhændelsesvinklen et godt stykke over den kritiske vinkel (trin 3.4.). Antistofdetektion mindskes også af overdreven fluorophore ustabilitet, som kan begrænse evnen til at kvantificere opholdstid. Når du støder på dette problem, skal du erstatte fluorophoren med en mere fotostabel fluorophore, som dem, der er bøjet til en triplet-state quencher47, eller sænke laserbelysningsintensiteten. Selv om ilt scavenging systemer er almindeligt anvendt i in vitro enkelt-molekyle eksperimenter for at undertrykke fluorophore photobleaching48,49, analysen beskrevet her kan give en meget generøs detektion vindue uden at gennemføre nogen ilt scavenging systemer15. Desuden kan ilt scavenging systemer i høj grad reducere eukaryote celle-fri oversættelse effektivitet. Derfor bør ilt scavenging systemer nøje evalueres forud for deres anvendelse med denne analyse.
Det er vigtigt at påpege, at små variationer i reagenspræparatet opdages af analysen på grund af dets enkeltmolekyleopløsning. For eksempel kan replikere oversættelsesudtrækspræparater vise forskellige aktiviteter, der måske eller måske ikke kan påvises ved hjælp af massemetoder. Desuden kan fryse-optøningscyklusser af oversættelsesekstrakt og andre reagenser hurtigt forringe oversættelsesaktiviteten. Vi anbefaler, at du udfører små pilotforsøg med lettilgængeligt materiale for at teste forholdene, før du planlægger en systematisk undersøgelse. Til en systematisk undersøgelse anbefales store præparater af oversættelsesreagenser, engangs-aliquots til fryse-/optøningsfølsomme reagenser og konsistens i udførelsen af protokoltrin. Oversættelsesekstrakt, der er flashfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 °C, udviser minimalt aktivitetstab i mindst to år. Anvendelse af disse foranstaltninger kan effektivt undertrykke eksperimentelle variationer og øge robustheden af enkeltmolekyleanalysen.
Da denne metode kombinerer eksisterende massecellefri oversættelsessystemer og in vitro-teknikker til enkeltmolekylebilleddannelse, diskuteres fejlfinding af generiske problemer på disse to områder ikke her. Eksempler på sådanne generiske spørgsmål omfatter lav kvalitet præparater af reporter mRNA eller PEGylated coverslip og lav oversættelse aktivitet celle ekstrakt. Her vil vi fokusere på spørgsmål, der er specifikke for denne metode. Ud over de mange tekniske spørgsmål, der er blevet drøftet i protokollen, kan et andet potentielt problem være lavt eller intet antistofbinding i flowkanalen for en oversættelsestilstand, der forventes at have god aktivitet. Der er flere muligheder for fejlfinding. Effektiviteten af biotinyleret mRNA-immobilisering til detektionsoverfladen kan vurderes ved at udvandre komplementære og fluorophorekonjugerede DNA-oligomerer til det immobiliserede mRNA og billeddannelse af fluorescerende DNA:RNA-duplexer. Kvaliteten af oversættelsen mix og biotinylerede reporter mRNA'er kan kontrolleres ved at køre bulk oversættelse assay. Efter at have udført en oversættelsesreaktion i en mRNA-immobiliseret strømningskanal kan oversættelsesreaktionsopløsningen desuden pipetters ud af kanalen og bruges i en reporteraktivitetsanalyse for at bekræfte forekomsten af in-channel oversættelse. Om nødvendigt kan der anvendes en for høj mRNA-overfladetæthed til in-channel-oversættelsesreaktionen for at gøre det lettere for reporteraktivitetsanalysen at opdage.
Den største begrænsning af denne analyse er dens beslutning for indledning kinetik. I denne analyse indeholder den direkte eksperimentelle produktion, første ankomsttid, både første rundes initieringstid og peptidforlængelsestiden til oversættelse af epitopen og 35 yderligere codoner. Selv om bidraget fra peptidforlængelsestiden kan korrigeres (trin 6.9.), er denne analyse derfor mest følsom over for måling af indledningskinetik, der forekommer i rækkefølge efter minutter, hvilket synes at være en generisk egenskab ved cap-dependent indledning15. Eksperimentelt er det let at tilpasse denne analyse til at studere andre indledningsmekanismer. Men hvis en indledning mekanisme opstår betydeligt hurtigt i størrelsesordenen sekunder, denne analyse er usandsynligt, at løse indledningen kinetik.
Den tilgang med et enkelt molekyle, der er beskrevet her, kombinerer enkeltmolekylebilleddannelse og ekstraktbaseret oversættelse for at muliggøre målinger af individuelle cap-afhængige oversættelseshændelser i realtid og under aktiv cellefri oversættelse. Analysen gør det nemt at skifte fra en masseoversættelsesanalyse til en enkelt molekyleanalyse, samtidig med at bulkoversættelseskinetik bevares. Således kan enkeltmolekyle kinetiske observationer fortolkes i direkte henvisning til tilsvarende bulkresultater. Tidligere metoder, herunder nyligt udviklede in vivo-tilgange 11,12,13,14, mangler opløsningen for kinetiske målinger af individuelle oversættelsesinitieringshændelser og kræver antagelser om oversættelsesmekanismer for at udtrække indledningstidsgennemsnit fra eksperimentelle observerbare. Den enkeltmolekylemetode, der præsenteres her, giver den første hypotesefri tilgang til kvantificering af den gennemsnitlige initieringstid for aktiv cap-afhængig oversættelse. Selv om massekinetiske målinger med en luminescensanalyse er blevet anvendt til at give de mest kvantitative og systematiske massekarakteristika af cap-afhængige oversættelseskinetik til dato46,50, måler den enkeltmolekyleanalyse, der er beskrevet her, gennemsnitlige indledning kinetiske ændringer med større følsomhed end bulkanalysen ( Figur7). Derudover bevarer enkeltmolekyledataene enkelt mRNA-oversættelseshusticitet og heterogenitet, egenskaber, der er gennemsnit i bulkmålinger. Oversættelseskinetikkens enkeltmolekyleopløsning kan bruges til systematiske kinetiske analyser til at afsløre indsigt i oversættelsesmekanismer, der ikke kan tilnås med andre metoder.
Denne analyse er kompatibel med eksisterende biokemiske og genetiske tilgange, der almindeligvis anvendes til oversættelsesundersøgelser. For eksempel kan translationel funktion af en bestemt faktor undersøges ved at generere faktor-udtømt ekstrakt og supplere det med vild-type eller mutant faktor. Ved at supplere fluorescerende mærket faktor kan undersøgelser desuden potentielt undersøge det kinetiske forhold mellem faktorbinding og oversættelsens progression. Med brug af to forskellige epitop / antistof par, kunne denne protokol potentielt udvides fra en en-farve assay til en to-farve assay, der muliggør samtidig påvisning af to forskellige kodning sekvenser. Denne tilpasning vil gøre det muligt at spore oversættelsen af forskellige læserammer og kan anvendes til frameshifting og start site udvælgelse undersøgelser. Alternativt kan et tofarvet system bruges til at detektere antistofinteraktioner med mærkede polypeptider kodet af åbne læserammer opstrøms og nedstrøms for at overvåge både opstrøms- og downstream-oversættelseshændelser på individuelle mRNA'er. Disse udvidelser kan muliggøre en lang række mekanistiske undersøgelser, der undersøger cap-afhængige oversættelse og dens regulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R01GM121847]; Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant / Core Grant (P30 CA008748); og MSKCC Functional Genomics Initiative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X oil objective, N.A. 1.49 | Olympus | UAPON 100XOTIRF | |
| Acryamide/bis (40%, 19:1) | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Alkaline liquid detergent | Decon | 5332 | |
| Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) | UCT Specialties, LLC | A0700 | |
| Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD | Andor | DU-897U-CSO-#BV | |
| Andor Solis software | Andor | For controlling the Andor EMCCD | |
| Band-pass filter | Chroma | 532/640/25 | |
| Band-pass filter | Chroma | NF03-405/488/532/635E-25 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio Inc | Biotin-PEG-SVA | |
| Coenzyme A free acid | Prolume | 309-250 | |
| Coolterm software | For controlling the syringe pump | ||
| Desktop computer | Dell | For controlling the microscope, camera, stage, and pump. | |
| Dichroic mirror | Semrock | R405/488/532/635 | |
| Direct-zol RNA microprep 50RNX | Fisher Scientific | NC1139450 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Epoxy | Devcon | 14250 | |
| Firefly luciferin D-Luciferin free acid | Prolume | 306-250 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP1185500 | |
| Hydrogen perioxide | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | |
| Immersion oil | Olympus | Z-81226A | Low auto-fluorescence |
| Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
| MEGASCRIPT T7 Transcription Kit | Thermo fisher | AM1334 | |
| Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific | 3048 | |
| Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 | Sigma-Aldrich | A9594 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio Inc | mPEG-SVA-5000 | |
| MS(PEG)4 | Thermo Scientific | 22341 | |
| NaCl (5M) | Thermo Scientific | AM9760G | |
| No 1.5 microscope Cover glass | Fisherband | 12-544-C | |
| Olympus Laser, 532nm 100mM | Olympus digital Laser system | CMR-LAS 532nm 100mW | |
| Olympus TirfCtrl software | Olympus | For controlling the laser intensity and incident angle | |
| Optical table | TMC vibration control | 63-563 | With vibration isolation |
| Phenol chloroform isoamyl alcohol mix | Sigma-Aldrich | 77617-100ml | |
| Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit | Thermo Scientific | 20160 | |
| Potassium hydroxide pellets | Sigma-Aldrich | P1767-500G | |
| Prior motorized XY translation stage | Prior | PS3J100 | |
| Prior PriorTest software | Prior | For controlling the Prior motorized stage | |
| Recombinant RNasin RNase Inhibitor | Promega | N2515 | |
| Stage top Incubator | In vivo scientific (world precision Instruments) | 98710-1 | With a custom built acrylic cage |
| Staining jar | Fisher Scientific | 08-817 | |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 43-4301 | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300212 | |
| SYBR green II | Fisher Scientific | S7564 | |
| Syringe | Hamilton | 1725RN | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | 55-3333 | |
| Tris (1M), pH = 7.0 | Thermo Scientific | AM9850G | |
| Ultrasonic Bath | Branson | CPX1800H | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Vaccinia Capping system | New England Biolabs | M2080S | |
| Zymo-Spin IC Columns | Zymo Research | C1004 |
References
- Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
- Gebauer, F., Hentze, M. W.
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J.
- Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
- Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
- Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
- Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
- Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
- Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
- Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
- Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
- Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
- Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
- Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
- Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
- Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
- Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
- Fedyukina, D. V., Cavagnero, S.
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
- Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
- Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
- Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
- Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
- Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
- Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
- Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
- Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
- Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
- White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
- Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
- Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
- Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).
