通过质量光度法快速测定抗体抗原亲和力

Summary

我们使用质量光度测量 （MP） 来描述抗原-抗体亲和力测量的单分子方法。基于MP的协议是快速，准确，使用非常少量的材料，不需要蛋白质修改。

Abstract

测量抗原-抗体相互作用的特异性和亲和力对于医疗和研究应用至关重要。在此协议中，我们描述了一种新的单分子技术，质量光度测量（MP），为此目的的实现。MP 是一种无标签和固定技术，在单分子水平上检测和量化抗体和抗原复合物的分子质量以及数量。MP 在几分钟内分析抗原抗体样品，从而能够精确确定结合亲和力，同时提供有关蛋白质的组细胞和寡聚状态的信息。这是一种简单明了的技术，只需要少量的蛋白质，不需要昂贵的消耗品。同样的程序可用于研究分子质量大于50kDa的蛋白质的蛋白质-蛋白质结合。对于多价蛋白相互作用，可以在一次测量中获得多个结合位点的亲和力。然而，单分子测量模式和缺乏标签存在一些实验限制。该方法在测量亚微摩尔相互作用亲亲度、分子质量为20 kDa或更大的抗原以及相对纯净的蛋白质样品时，可获得最佳效果。我们还描述了使用基本数据分析软件执行所需拟合和计算步骤的过程。

Introduction

抗体已成为分子生物学的无处不在的工具，并广泛应用于医学和研究应用。在医学方面，它们在诊断中至关重要，但它们的治疗应用也在不断扩大，新的抗体疗法也在不断开发^{1、2、3、4。}抗体的科学应用包括许多不可或缺的实验室技术，如免疫荧光^5、免疫沉淀^6、流细胞学^7、ELISA和西印迹。对于每个应用，获得抗体结合特性的准确测量，包括结合亲和力和特异性，至关重要。

自1990年引进第一台商用表面表面质共振（SPR）仪器以来，光学生物传感器已成为抗体表征的”黄金标准”，但包括ELISA在内的其他技术也经常用于测量^{抗体亲和力8、9。}这些方法通常需要对分析的分子进行固定或标记，这可能会影响兴趣的相互作用。它们也相对缓慢，涉及多个检测步骤，然后才能收集结果进行数据分析。最近研制的单分子方法，质量光度测量（MP），当分子降落在显微镜表面时，直接检测溶液中的分子^。MP 采用的基于光散射的光学检测不需要蛋白质标记或修改。干涉测量散射显微镜将单个蛋白质分子记录为图像中出现的黑点（图1D），在一分钟的数据采集¹²中可以检测到几千个分子。每个粒子生成的信号被量化，并计算其对比度值（相对黑暗）。干涉测比值与蛋白质的分子质量成正比，从而可以识别抗原-抗体混合物中的结合和自由物种。同时，通过计算分子着陆事件，MP直接测量物种种群。这为基于 MP 的方法提供了独立量化多个绑定站点的亲缘性的独特功能。

抗原（Ag） 分子与完整抗体 （Ab） 的两个结合位点结合可描述为：

平衡关联常数 K_a1 和 K_a2 定义为：

其中c_i和 f _i分别表示成分 i 的浓度和分数。总抗原浓度 （c_Ag）_托特可以表示为：

由于抗体（c_Ab）_{托特和抗原} （c_Ag） tot 的总_浓度已知 ，此方程可用于直接拟合从 MP 测量中获得的实验组分分数，并计算平衡关联常数 K_a1 和 K_a2（ 参见 补充信息）。

MP数据也可用于估计两个抗体结合位点¹¹之间的合作性。对于具有相同微观结合常数的两种抗体副托普，描述 Ab + 种群过程的统计因子阿格和阿布|Ag₂复合物规定，表观宏观平衡常数K_a1和K_a2在数值上不相等，而K_a1 = 4K_a2。因此，K_a1 < 4K_a2的实验值表示两个抗体结合位点之间的正合作率。同样，K_a1 > 4K_a2表示负合作性。

抗原-抗体结合亲和力的MP测量速度快，需要少量材料。用于平衡常量计算的MP质量分布提供了有关样品特性的附加信息，并可用于在单个实验中评估样品纯度、寡聚化和聚合。同样的方法可用于测量高亲和力蛋白-蛋白质结合，MP对于研究多价蛋白相互作用特别有用。多蛋白复合物通常具有较大的分子质量，是 MP 检测的最佳选择，单分子数据可用于同时测量组分测量和计算多个结合位点的亲缘性。使用基于批量的方法通常很难获取此信息。

如果不进行修改，目前的协议适用于测量相对高的亲和力，亚微摩尔相互作用的分子质量为20kDa或更大的抗原。为了获得最佳效果，蛋白质储存应具有高纯度，但没有特定的缓冲液要求。通过使用MP，抗原抗体结合可以在五分钟内评估。准确的Kd 计算所需的数据收集_和分析可以在 30 分钟内完成。

Protocol

1. 准备流室 清洁玻璃盖玻片 使用用蒸馏水、乙醇和异丙醇洗瓶，按以下顺序冲洗 24 mm x 50 mm 盖玻片：水、乙醇、水、异丙醇、水。用干净的氮气流擦干盖玻片。重要的是要从上到下冲洗盖玻片，用软尖钳握住底角。以相同方向干燥盖玻片，以避免从钳子中转移污染物（图2A）。 同样，用蒸馏水、乙醇和蒸馏水冲洗 24 mm x 24 mm 盖玻片。用干净的氮气流擦…

Representative Results

我们之前已经使用基于MP的α 11研究了人类血栓（HT）和小鼠单克隆抗人类血栓抗体（AHT）的相互作用。由于HT（37 kDa）的分子质量低于40kDa检测限值，因此最大样品浓度可以超过50 nM MP 浓度限制，而不会对质量分布的分辨率产生负面影响。实验计划为定型系列，AHT抗体浓度为25 nM，HT浓度为7.5 nM、15 nM、30 nM、60 nM和120 nM。 图3 显示了抗原抗体混合物和抗体样?…

Discussion

此处概述的基于质量光度测量的协议提供了一种快速、准确的测量抗原-抗体结合亲和力的方法。MP 分析使用非常少量的材料，并且可以从相同的数据评估其他信息（包括测定、寡聚化和纯度）（图5）。如果不作修改，此方法适用于在大约 5 nM 至 500 nM 范围内的分离常数的测量，以及分子质量约为 20 kDa 或更大的配体分子的测量。当至少一个结合伙伴的分子质量大于50kDa时，?…

Materials

AcquireMP	Refeyn		MP data collection software
Anti-human thrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators	Thorlabs	CTA10	cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24×24 mm	Globe Scientific	1405-10
Coverslips 24×50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP data processing software
Forceps	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersion oil	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		spreadsheet
OneMP	Refeyn		Mass Photometry instrument
Origin	OriginLab		scientific graphing software
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Syringe filter	Millipore	SLGSR33SS	buffer and sample filtering