Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie
Summary
We beschrijven een single-molecule benadering van antigeen-antilichaam affiniteit metingen met behulp van massa fotometrie (MP). Het MP-gebaseerde protocol is snel, nauwkeurig, gebruikt een zeer kleine hoeveelheid materiaal en vereist geen eiwitmodificatie.
Abstract
Metingen van de specificiteit en affiniteit van antigeen-antilichaam interacties zijn van cruciaal belang voor medische en onderzoekstoepassingen. In dit protocol beschrijven we de implementatie van een nieuwe single-molecule techniek, massa fotometrie (MP), voor dit doel. MP is een label- en immobilisatievrije techniek die moleculaire massa’s en populaties van antilichamen en antigeen-antilichaamcomplexen op één molecuulniveau detecteert en kwantificeert. MP analyseert het antigenantilichaammonster binnen enkele minuten, waardoor de bindingsaffiniteit nauwkeurig kan worden bepaald en tegelijkertijd informatie kan worden verstrekt over de stoichiometrie en de oligomeric toestand van de eiwitten. Dit is een eenvoudige en eenvoudige techniek die alleen picomole hoeveelheden eiwit en geen dure verbruiksgoederen vereist. Dezelfde procedure kan worden gebruikt om eiwit-eiwitbinding te bestuderen voor eiwitten met een moleculaire massa groter dan 50 kDa. Voor multivalente eiwitinteracties kunnen de affiniteiten van meerdere bindingsplaatsen in één meting worden verkregen. Echter, de single-molecule wijze van meting en het ontbreken van etikettering legt een aantal experimentele beperkingen. Deze methode geeft de beste resultaten wanneer toegepast op metingen van sub-micromolar interactie affiniteiten, antigenen met een moleculaire massa van 20 kDa of groter, en relatief zuivere eiwitmonsters. We beschrijven ook de procedure voor het uitvoeren van de vereiste montage- en berekeningsstappen met behulp van basisgegevensanalysesoftware.
Introduction
Antilichamen zijn alomtegenwoordige instrumenten van moleculaire biologie geworden en worden op grote schaal gebruikt in zowel medische als onderzoekstoepassingen. In de geneeskunde zijn ze van cruciaal belang in de diagnostiek, maar hun therapeutische toepassingen worden ook uitgebreid en nieuwe op antilichamen gebaseerde therapieën worden voortdurend ontwikkeld1,2,3,4. De wetenschappelijke toepassingen van antilichamen omvatten vele onmisbare laboratoriumtechnieken zoals immunofluorescentie5,immunoprecipitatie6, stroomcytometrie7,ELISA en westerse blotting. Voor elk van deze toepassingen is het verkrijgen van nauwkeurige metingen van de bindende eigenschappen van het antilichaam, inclusief bindende affiniteit en specificiteit, van cruciaal belang.
Sinds de introductie van het eerste commerciële oppervlakteplasmon resonantie (SPR) instrument in 1990 zijn optische biosensoren de “gouden standaard” van antilichaamkarakterisering geworden, maar andere technieken, waaronder ELISA, worden ook routinematig gebruikt om antilichaamaffinities8,9te meten . Deze methoden vereisen meestal immobilisatie of etikettering van de geanalyseerde moleculen, die mogelijk van invloed kunnen zijn op de interactie van belang. Ze zijn ook relatief traag, waarbij meerdere teststappen voordat de resultaten kunnen worden verzameld voor gegevensanalyse. Een onlangs ontwikkelde single-molecule methode, massa fotometrie (MP), detecteert moleculen direct in oplossing wanneer ze landen op het oppervlak van de microscoop coverslip10,11. De op lichtverstrooiing gebaseerde optische detectie die MP gebruikt, vereist geen eiwitlabeling of modificatie. Individuele eiwitmoleculen worden geregistreerd door de interferometrische verstrooiingsmicroscoop als donkere vlekken die in de afbeelding verschijnen(figuur 1D), en enkele duizenden moleculen kunnen worden gedetecteerd tijdens de data-acquisitie van één minuut12. Het signaal dat door elk afzonderlijk deeltje wordt gegenereerd, wordt gekwantificeerd en de contrastwaarde (relatieve duisternis) wordt berekend. De interferometrische contrastwaarden zijn evenredig aan de moleculaire massa’s van de eiwitten, waardoor gebonden en vrije soorten in het antigeen-antilichaammengsel kunnen worden geïdentificeerd. Tegelijkertijd meet MP door moleculaire landingsgebeurtenissen te tellen rechtstreeks de soortenpopulaties. Dit geeft MP gebaseerde methoden een unieke mogelijkheid om onafhankelijk te kwantificeren affiniteiten van meerdere bindende sites.
Binding van de antigeen (Ag)moleculen aan de twee bindende plaatsen van het intacte antilichaam (Ab) kan worden omschreven als:
met de evenwichtsassociatie constanten Ka1 pt Ka2 gedefinieerd als:
waar ci pt fi respectievelijk concentratie en fractie van het onderdeel ivertegenwoordigen. De totale antigeenconcentratie (cAg)tot kan worden uitgedrukt als:
Aangezien de totale concentraties van het antilichaam (cAb)tot en antigeen (cAg)tot bekend zijn, kan deze vergelijking worden gebruikt om rechtstreeks te passen bij de experimentele componentfracties verkregen uit de MP-metingen en de evenwichtsstifies Ka1 pt Ka2 te berekenen (zie Aanvullende informatie).
De MP-gegevens kunnen ook worden gebruikt om de samenwerking tussen de twee antilichaambindende sites11te schatten . Voor twee antilichaamparatopes met identieke microscopische bindende constanten, de statistische factoren die het proces van bevolking van Abbeschrijven · Ag pt Ab· Ag2 complexen dicteren dat de schijnbare macroscopische evenwichtsconstanten Ka1 pt Ka2 zal niet numeriek gelijk zijn, en Ka1 = 4Ka2. Daarom wijzen de experimentele waarden van Ka1 < 4Ka2 op een positieve samenwerking tussen de twee antilichaambindingslocaties. K a1 > 4Ka2 geeft ook negatieve samenwerking aan.
MP-metingen van de antigeen-antilichaambinding zijn snel en vereisen een kleine hoeveelheid materiaal. De MP-massaverdelingen die worden gebruikt voor evenwichtsconstante berekeningen bieden aanvullende informatie over de eigenschappen van het monster en maken de beoordeling van de monsterzuiverheid, oligomerisatie en aggregatie in één experiment mogelijk. Dezelfde methode kan worden gebruikt om hoge affiniteit eiwit-eiwit binding te meten, en MP is vooral nuttig voor studies van multi-valent eiwit interacties. Multi-eiwit complexen hebben meestal grote moleculaire massa’s, optimaal voor MP detectie, en single-molecule gegevens kunnen worden gebruikt om stoichiometrie te meten en affinities van meerdere bindende sites tegelijk te berekenen. Deze informatie is meestal moeilijk te verkrijgen met behulp van bulk-gebaseerde methoden.
Zonder wijzigingen is het huidige protocol geschikt voor metingen van relatief hoge affiniteit, submicromolar interacties met antigenen van een moleculaire massa van 20 kDa of groter. Voor optimale resultaten moeten eiwitvoorraden van hoge zuiverheid zijn, maar er zijn geen specifieke buffervereisten. Door mp te gebruiken, kan de antigeen-antilichaambinding in minder dan vijf minuten worden beoordeeld. Het verzamelen en analyseren van gegevens die nodig zijn voor nauwkeurige Kd-berekeningen kan binnen 30 minuten worden uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het op massafotometrie gebaseerde protocol dat hier wordt beschreven, biedt een snelle en nauwkeurige methode voor het meten van antigeen-antilichaambindingsafdijningen. MP-analyse maakt gebruik van een zeer kleine hoeveelheid materiaal, en aanvullende informatie, waaronder stoichiometrie, oligomerisatie en zuiverheid, kan worden beoordeeld aan de hand van dezelfde gegevens(figuur 5). Zonder wijzigingen is deze methode van toepassing op de metingen van dissociatieconstanten in het ongeveer 5…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Keir Neuman voor zijn kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het intramurale programma van de NHLBI, NIH.
Materials
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24×24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
Referências
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H. Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer’s Disease: Pitfalls and Promise. Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).
- Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer – A review of literature. Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).
- Waldmann, T. A. Immunotherapy: past, present and future. Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Rosenberg, M. I. . Protein Analysis and Purification. , (2005).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance. Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).
- Lofgren, J. A., et al. Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab. The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
- Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
- Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).
- Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
